發(fā)布時間：2020-06-01 12:51

【摘要】：本實驗采用菲牛蛭作原材料,對其含有的抗凝血物質(zhì)進(jìn)行分離純化,得到抗凝血活性多肽。首先對菲牛蛭粉末的基本成分進(jìn)行測定,包括水分、灰分、蛋白和脂肪的含量。測定結(jié)果表明:菲牛蛭為一種高蛋白原料,蛋白含量可達(dá)68.1±0.10%,其它成分含量均較低。采用pH沉淀法、丙酮提取法、水提醇沉法、堿性蛋白酶酶解法、硫酸銨沉淀法五種方法對菲牛蛭蛋白進(jìn)行粗提。堿性蛋白酶提取得到的菲牛蛭多肽的抗凝血活性最高,為 35.47±0.55U/g。為優(yōu)化堿性蛋白酶提取工藝,研究了加酶量(U/g)、時間(min)、料液比和pH對堿性蛋白酶提取效果的作用,通過正交實驗確定最佳工藝條件為:加酶量為2000 U/g,酶解時間為250 min,料液比為1:15,pH為9,可得抗凝血活性為72.3 U/g,水解度為 31.6%。得到高抗凝血物質(zhì)的同時,另對抗凝血物質(zhì)進(jìn)行了抗氧化活性的測定,包括羥基自由基的清除、還原能力的測定、超氧陰離子的清除。測定結(jié)果表明:菲牛蛭酶解的抗凝血活性多肽表現(xiàn)出來一定的羥基自由基清除能力、一定的還原力和明顯的超氧陰離子清除能力。為了進(jìn)一步對提取物質(zhì)進(jìn)行分離純化,本實驗使用陰離子交換層析DEAE Sephadex A-50 和凝膠過濾層析 Sephadex G-50 進(jìn)行分離。DEAE Sephadex A-50 得到三個組分的干燥產(chǎn)品,結(jié)果表明主峰HA為活性峰,活性為202.5±2.15 U/g。用Sephadex G-50凝膠過濾層析進(jìn)行進(jìn)一步純化,得到具有更高活性的HA2(358.96±1.56U/g)。收集洗脫峰,進(jìn)行冷凍干燥。對得到的抗凝物質(zhì)進(jìn)行性質(zhì)的分析,通過紫外光譜掃描得出,提取液在295 nm處有最大吸收峰。傅里葉紅外光譜分析得出了菲牛蛭多肽在500-4000 cm-1范圍內(nèi)酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ的紅外圖譜。對抗凝血活性多肽的含量進(jìn)行測定結(jié)果表明,在抗凝血活性為358.96 U/mL時,多肽濃度為0.7781 mg/mL,最終得出所純化的多肽抗凝血比活為461.33 U/mL�；|(zhì)輔助激光解析飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜得出活性物質(zhì)為一種寡肽。對抗凝血物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定分析表明,此抗凝血活性物質(zhì)適合在中性或者弱酸性條件下,在高溫下極易變性失活,應(yīng)保存在低溫環(huán)境中。
【圖文】：

圖１－１菲牛蛭逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉ邋ｌｉｒｕｄｉｎａｒｉａ邋ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ逡逑學(xué)成分逡逑動物，含有１７－１９種氨基酸成分，八種人的作用。菲牛蛭中還含有微量元素和脂肪。另外，菲牛蛭中還含有豐富的脂肪酸，心腦血管疾病等功能。菲牛蛭中提取的脂的研究和開發(fā)也具有重大的價值［Ｗ｜。苗艷麗種為人體需耍的常量元素，四種是人體必素Ｃａ的含量均較高含量達(dá)到了邋１４．１１邋ｍｇ／ｇ。１．３７ｍｇ／ｇ，１．３３ｍｇ／ｇ［７＼根據(jù)藥理研究發(fā)微量元素Ｆｅ、Ｍｇ、Ｚｎ有關(guān)。逡逑物質(zhì)主要來源于頭部唾液腺和分泌的唾液［４的是防止血液凝固，易于吸血。菲牛蛭中。

圖２－１凝血酶滴定現(xiàn)象逡逑ｇ．２－１邋Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ邋ｏｆ邋ｃｌｏｔｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｔｅ，加入４０邋ｍＬ邋０．９％的ＮａＣＨ容液（的三氯醋酸溶液調(diào)ｐＨ至２．５，ｎ離心１５邋ｍｉｎ，棄沉淀，收集上離心１５ｍｉｎ，上清液即粗提液，，加入４０邋ｍＬ含水１５％的冷丙酮丙酮溶液和菲牛蛭千粉的混合物４邋°Ｃ，邋８０００邋ｒ／ｍｉｎ下離心１５邋ｍｉｎ，Ｌ三氯乙酸溶液溶，４邋°Ｃ，８０００邋ｌｍｏｌ／Ｌ調(diào)ｐＨ到７．０，，測定菲，加入４０邋ｎｉＬ蒸餾水，磁力攪拌
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284.2

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本文編號：2691511