發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 10:40

【摘要】：金不換為藥用植物Veratrilla baillonii Franch的干燥根,其味苦性寒,清熱解毒。能用于肺熱咳嗽、痢疾、燒傷等。其主要化學(xué)成分為(裂)環(huán)烯醚萜苷類和Tk咕酮類,其中環(huán)烯醚萜苷類具有保肝、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F.)系衛(wèi)矛科(Celastraeeae)雷公藤屬(Tripterygium)一年生藤本植物,藥性辛、涼,味苦,有大毒,歸肝、腎經(jīng),具有祛風(fēng)除濕,活血通絡(luò),消腫止痛,殺蟲(chóng)解毒,但有大毒,限制了其臨床應(yīng)用。毛茛科烏頭屬藥材雪上一枝蒿(Aconitum brachypodum Diel)常被云南當(dāng)?shù)厝嗣裼糜谥委熖弁春脱装Y相關(guān)的疾病。本實(shí)驗(yàn)室前期表明金不換能解由烏頭類引起的中毒,并且基因芯片結(jié)果表明金不換與雪上一枝蒿配伍可能具有協(xié)同抗炎作用。故本文一方面從雷公藤誘導(dǎo)的藥物性肝損傷來(lái)了解金不換的保肝解毒作用,另一方面研究金不換與雪上一枝蒿配伍的協(xié)同抗炎作用。1.金不換保肝實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象,灌胃給藥金不換水提物(WVBF)(0,25,50,100 mg/kg)7天后,再灌胃給藥雷公藤多苷(TG)片270 mg/kg 4天,以體重變化,血液生化指標(biāo),病理切片,MicroRNA-122(miR-122)的表達(dá)量以及代謝酶的改變來(lái)評(píng)價(jià)WVBF對(duì)TG致小鼠肝毒性的解救作用;體外實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,采用MTT法研究不同濃度的雷公藤甲素(TP)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響,選擇20 nM的TP為致毒模型,研究金不換水提物中6個(gè)單體與TP合用對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響,12.5μM、25μM、50μM三個(gè)濃度的龍膽苦苷為解藥組,2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量,JC-1檢測(cè)線粒體膜電位(△Ψm)變化,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)肝藥酶CYP3A4/1A2和線粒體DNA(mtDNA)表達(dá)量變化。由體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,雷公藤多苷片使小鼠的肝組織發(fā)生了明顯異常病變,顯著增加小鼠血液中ALT、AST、ALP、LDH含量,升高肝臟中MDA含量和降低了GSH、SOD的含量,并且抑制了MicroRNA-122的表達(dá);金不換可以緩解雷公藤多苷片所導(dǎo)致的肝功能及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的紊亂。由體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,12.5μM、25μM、50μM龍膽苦苷孵育24 h能減弱TP所致的HepG2細(xì)胞mtDNA表達(dá)量下降、線粒體膜電位損傷。12.5μM、25μM、50μM龍膽苦苷孵育24 h能緩解雷公藤甲素所致的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。2.金不換與雪上一枝蒿協(xié)同抗炎作用采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型探討雪上一枝蒿總生物堿(CFA)與WVBF之間的協(xié)同抗炎作用,利用中效原理法,判斷雪上一枝蒿醇提物與金不換協(xié)同作用的配伍最佳比例,采用qPCR方法檢測(cè)iNOS,TNF-α,COX-2和IL-6mRNA表達(dá)的變化,DCFH-DA熒光探針標(biāo)記巨噬細(xì)胞檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平,用熒光探針Fluo-3/AM標(biāo)記細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)Ca~(2+)水平。結(jié)果顯示CFA、WVBF、CFA與WVBF配伍比例為1:2、1:5、1:10組,能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO產(chǎn)生,但是只有CFA:WVBF=1:10配伍比例下,各種濃度混合物相互作用指數(shù)均小于1,表現(xiàn)為協(xié)同抗炎作用;CFA單獨(dú)組、WVBF單獨(dú)組、CFA:WVBF=1:10配伍組對(duì)iNOS,TNF-α,COX-2,IL-6基因表達(dá)均有顯著性抑制作用,配伍組對(duì)iNOS基因抑制作用明顯優(yōu)于CFA組和WVBF組,而對(duì)COX-2、IL-6和TNF-α基因表達(dá)的抑制效果相對(duì)較弱。CFA、WVBF和配伍組均能減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧釋放增加和胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高,且配伍組抑制作用強(qiáng)于單藥組。結(jié)論:(1)WVBF可以通過(guò)抑制TG誘導(dǎo)的MicroRNA-122的表達(dá)上調(diào)、血清生化指標(biāo)(ALT、AST、ALP、LDH)和MDA升高和上調(diào)TG所致的GSH、SOD含量下降來(lái)保護(hù)TG引起的小鼠肝功能紊亂。(2)WVBF中主要活性成分龍膽苦苷能通過(guò)上調(diào)TP誘導(dǎo)的mtDNA表達(dá)減少、線粒體膜電位丟失和減少細(xì)胞內(nèi)ROS釋放來(lái)減弱TP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性。(3)CFA與WVBF=1:10為最佳配伍比例,且通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS基因表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)ROS釋放增多和Ca~(2+)濃度升高發(fā)揮協(xié)同抗炎作用。
【圖文】：

0.13％，0.99％。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 雷公藤多苷片中雷公藤甲素的鑒定TG 中主要的活性成分和有毒成分為 TP，所以我們通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定了 TG 中 TP 的含量。用乙酸乙酯萃取 TG，分離純化后用于 HPLC。色譜柱為Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm，，5 μm，日本），流動(dòng)相由乙腈（A）和水（B）組成，梯度程序?yàn)椋?~15 min，25%~32%A，15~35 min，32~42%A，35~56min，42~85%A，流速為 1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為 218 nm。通過(guò)比較其保留時(shí)間和測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量（圖 a 和 b）來(lái)鑒定 TP。

0.05 compared with control; # P < 0.05, ## P < 0.01 compared with TG ).2.3.2 病理切片結(jié)果從圖 2.3 可以看出，TG 處理 7 天后，組織學(xué)上觀察到肝臟出現(xiàn)不同程度理病變（箭頭所指）。如圖 2.3B 所示，TG 組的小鼠肝組織發(fā)生了病變，包括細(xì)胞的中度水腫，炎性浸潤(rùn)，細(xì)胞變性和壞死。WVBF 治療（25-100 mg / kg后，所有的病理?yè)p傷在一定程度上出現(xiàn)緩解（圖 2.3 C-E）。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2691361