【摘要】：肺癌的發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤的首位,化療在肺癌防治過程中一直處于主導地位,積極開發(fā)有效的肺癌防治藥物尤為重要。炎性反應是腫瘤的十大特征之一,其中中性粒細胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的炎性細胞,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用已經受到了廣泛重視。中性粒細胞在不同的腫瘤微環(huán)境中可以極化為促癌和抑癌兩種表型。最近研究表明:高凝狀態(tài)所造成的肺栓塞大大縮短了肺癌患者的生存期,成為肺癌患者的第二大死因,而腫瘤相關中性粒細胞(TANs)活化后形成的中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)是造成肺癌相關高凝狀態(tài)以及血栓形成的主要原因。然而,中性粒細胞和高凝狀態(tài)與肺癌發(fā)生之間的關系尚不明確。大黃素是大黃的有效成分之一,具有抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性,其防治腫瘤作用是否與影響中性粒細胞表型相關未有報道。本研究目的是探究中性粒細胞和高凝狀態(tài)與肺癌發(fā)生的關系,以及大黃素是否能影響中性粒細胞表型防治高凝和肺癌及其作用機制。本研究分體內,體外和機制研究三個部分。在體外研究中,用ATRA誘導HL-60分化為HL-60N1,繼續(xù)用TGF-β誘導HL-60N1分化為HL-60N2,獲取兩種表型的中性粒細胞,以不同濃度的大黃素處理HL-60N1和HL-60N2,MTT法檢測大黃素對細胞增殖的影響;Annexin V-FITC/PI染色檢測大黃素對細胞凋亡的影響;激光全息檢測大黃素對細胞形態(tài)、細胞體積的影響;中性紅攝取檢測大黃素對細胞攝取能力的影響。在體內研究中,建立烏拉坦致肺癌模型,檢測肺癌發(fā)生發(fā)展過程中凝血狀態(tài)及肺泡中性粒細胞的數目、CD66b的表達和NETs形成的變化;采用HE染色檢測小鼠肺組織病理變化,評價大黃素對肺癌的防治效果,并檢測大黃素在肺癌的防治過程中凝血狀態(tài)及中性粒細胞數量和表型變化;采用Ly6G mAb耗竭中性粒細胞,分析中性粒細胞在肺癌發(fā)生過程中的作用,以及和大黃素合用的效果。建立LLC異位移植瘤模型,檢測過繼性輸注HL-60N1和HL-60N2細胞對腫瘤生長的作用,免疫印記法檢測瘤組織內中性粒細胞MPO、CD66b的表達,探究大黃素在治療腫瘤過程中對中性粒細胞的調節(jié)作用和高凝防治作用。為了進一步探索大黃素調節(jié)中性粒細胞防治高凝狀態(tài)和肺癌的機制,在體外實驗中,檢測大黃素對HL-60N1和HL-60N2細胞CD66b表達、NETs形成、吞噬作用、自噬能力和ROS產生的影響,評價大黃素對中性粒細胞表型和功能的影響。在烏拉坦肺癌模型中,免疫組化檢測大黃素對烏拉坦誘導肺癌小鼠肺組織中性粒細胞表型標志物(Ly6G和CD66b)和NETs形成標志物(PAD4和CitH3)表達的影響;ELISA檢測肺泡細胞因子IFN-γ,IL-12、ROS、IL-6,TNF-α和TGF-β1的表達。最后,采用網絡藥理學預測并解釋大黃素調節(jié)腫瘤相關中性粒細胞防治高凝和肺癌的分子機制。體外結果顯示,HL-60經ATRA誘導后分葉核明顯,經TGF-β誘導后細胞體積增大,CD66b表達增多;大黃素在20μM時,對HL-60N1細胞活性幾乎無影響,但可以促進HL-60N1細胞對中性紅的攝取;對HL-60N2細胞,大黃素抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,并伴隨著細胞體積的減小。體內結果顯示,在烏拉坦肺癌模型中,肺組織癌變前,小鼠已經出現了高凝狀態(tài)和N2型中性粒細胞增多;在肺癌發(fā)生后,N2型中性粒細胞數目持續(xù)增多,凝血持續(xù)加重;大黃素治療后,肺組織結節(jié)數目,癌變面積明顯減小,高凝狀態(tài)得到改善,肺泡N2型中性粒細胞聚集和NETs形成明顯減少。Ly6G mAb耗竭中性粒細胞可以改善高凝狀態(tài)并防治肺癌,但減弱大黃素對肺癌的防治作用。在LLC異位移植瘤模型中,大黃素阻止過繼性輸注HL-60N2細胞的促凝和促腫瘤作用,與過繼性輸注HL-60N1協同抑制腫瘤生長,免疫印記結果顯示,大黃素促進瘤組織中性粒細胞MPO的表達,抑制CD66b的表達。機制研究表明,大黃素在體外促進HL-60N1細胞的吞噬作用、增加活性氧的產生;對于HL-60N2細胞,大黃素降低CD66b的表達和NETs的形成,抑制自噬能力。在烏拉坦肺癌模型中,大黃素可以抑制肺組織中性粒細胞CD66b、PAD4和Cit-H3的表達;ELISA檢測結果顯示大黃素升高肺泡中IFN-γ、IL-12和ROS水平,降低IL-6、TNF-α和TGF-β1水平。網絡藥理學分析表明,大黃素通過調節(jié)Jak-Stat,Toll樣受體等信號通路,抑制TANs自噬,使NETosis這一生物過程轉化為凋亡,從而逆轉TANs的促凝和促癌效應。綜上所述,中性粒細胞增多癥和高凝狀態(tài)與烏拉坦肺癌進展呈正相關;CD66b~+中性粒細胞(N2)在肺組織的聚集和NETs所造成的高凝狀態(tài)共同導致了肺癌的發(fā)生;大黃素選擇性抑制N2中性粒細胞的激活,并保留N1中性粒細胞防治高凝和肺癌。
【圖文】：

每孔繼續(xù)加入 0.1 mL 的 0.072%中性紅溶液，30 min 后用 96 孔板離心機離心，棄上清，PBS 洗 3 次，每次 3 min，接著每孔加入細胞溶解液（乙酸：無水乙醇=1：1）100uL，靜置 6-8h，酶標儀測在 540 nm 處的 OD 值，實驗重復 3 次。2.3.6 數據分析使用 GraphPad Prism 7.0 版軟件對實驗數據進行作圖和統(tǒng)計學分析。兩組間的差異用 t 檢驗來進行評價。*P <0.05 有統(tǒng)計學差異，，**P <0.01 為極顯著差異。2.4 實驗結果2.4.1 HL-60 分化為 HL-60N1 和 HL-60N2 的檢測HL-60 細胞核較大，無分頁核，經過 ATRA 誘導 7 天后，出現分頁核（如圖 2-1），CD66b 的表達變化無明顯變化（如圖 2-2）；又經過 TGF-β誘導后細胞核分頁更明顯、體積增大（如圖 2-1），CD66b 的表達明顯增加（如圖 2-2）。

圖 2-2 細胞 CD66b 的表達Fig.2-2 The CD66b expression of cells2.4.2 大黃素對 HL-60N1 和 HL-60N2 細胞增殖能力的影響大黃素在低濃度時對 HL-60N1 的增殖能力影響較小，在 20 μM 以下對 HL-60N1的增殖能力幾乎無影響，在 40 μM 時出現抑制作用。大黃素在 20 μM 可以明顯抑制HL-60N2 的增殖，并呈劑量依賴性（如圖 2-3）。（*P < 0.05， **P < 0.01 vs HL-60N1）。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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2 趙紅;張健;;從“虛、痰、瘀、毒”論肺癌的病因病機[J];中國醫(yī)學創(chuàng)新;2013年19期

3 楊紅麗;董少婷;王爽;;微環(huán)境對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響[J];實用腫瘤雜志;2013年01期

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本文編號：2691135