【摘要】：目的:觀察獨(dú)活香豆素對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞活性和炎癥因子IL-1β、TNF-α的影響,探討?yīng)毣钕愣顾貙ι窠?jīng)元樣PC12細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制,為獨(dú)活香豆素治療帕金森病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。材料與方法:1.含藥血清制備:應(yīng)用隨機(jī)法,將大鼠分四組為:正常組(20只)、吐溫80組(10只)、塞來昔布組(10只)、獨(dú)活香豆素組(10只)。正常組大鼠予生理鹽水灌胃,吐溫80組予0.08%吐溫80,2ml/次,塞來昔布和獨(dú)活香豆素組大鼠給藥劑量按照人與大鼠給藥劑量換算公式進(jìn)行計(jì)算,塞來昔布組按照說明書中成人每天常規(guī)用量進(jìn)行折算,獨(dú)活香豆素組大鼠實(shí)際給藥量按照成人每天10g獨(dú)活飲片的3倍~([8])量進(jìn)行折算。給藥時間為上午8∶00~10∶00,每日1次,2ml/次/只,連續(xù)給藥7天。最后一次給藥2h后腹主動脈取血,靜置2h,2000r/min離心10min后分離血清。經(jīng)56℃,30min滅活,0.22μm濾膜過濾滅菌,放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.PC12細(xì)胞分化與培養(yǎng):大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(PC12)經(jīng)神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞,然后選擇含15%馬血清的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),取對數(shù)生長期,按照1×10~5/ml密度,接種于96孔板中培養(yǎng),100μl體系,待培養(yǎng)24小時細(xì)胞貼壁生長后,進(jìn)行Lactacystin與含藥血清濃度的篩選。3.Lactacystin作用濃度的確定:將Lactacystin配制成1mmol/l的母液,然后將Lactacystin母液稀釋為0μmol/l、5μmol/l、10μmol/l和20μmol/l終濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中,作用時間為24h,通過MTT檢測各組細(xì)胞相對存活率,最后確定Lactacystin誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞作為帕金森病細(xì)胞模型的最佳作用濃度為5μmol/l。4.含藥血清作用濃度及時間的確定:取對數(shù)生長期的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞,按照1×10~5/ml密度,接種于96孔板中培養(yǎng),100μl體系,待培養(yǎng)24小時細(xì)胞貼壁生長后,將細(xì)胞共分成16組,分別為空白對照組(馬血清)、正常對照血清組、模型血清組、吐溫血清組、塞來昔布血清組、獨(dú)活香豆素血清組,再將除空白對照組以外的含藥血清組分為10%、15%、20%三個濃度組,更換相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基,保護(hù)時間分別為24h、48h后,除空白對照組和正常血清對照組外,其余各組分別加入5μmol/l Lactacystin作用24h。最后應(yīng)用MTT檢測細(xì)胞相對存活率,確定最佳含藥血清濃度為15%,最佳的作用時間為24h。5.分組與給藥:實(shí)驗(yàn)分為五組,分別為正常對照組、模型組、吐溫組、塞來昔布組、獨(dú)活香豆素組。按照以1×10~5/ml的密度將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞一部分接種于兩個96孔板中培養(yǎng),同時一部分接種于6孔板中培養(yǎng),分別選取濃度為15%不同的含藥血清培養(yǎng)24h后,除了正常對照組外其余各組分別加入5μmol/l Lactacystin,24h后收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。6.指標(biāo)檢測及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用MTT檢測各組細(xì)胞活性。應(yīng)用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α的蛋白含量。應(yīng)用RT-PCR法檢測IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用x±S表示多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.Lactacystin作用濃度的確定結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MTT法測定的吸光度值均隨著Lactacystin濃度增加而逐漸降低,即Lactacystin有明顯劑量依賴性地抑制細(xì)胞活性的作用。當(dāng)Lactacystin作用濃度為5μmol/l時,細(xì)胞相對存活率最高。因此選擇濃度為5μmol/l,作用24h為誘導(dǎo)神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的刺激條件。2.含藥血清作用時間和濃度的確定經(jīng)篩選確定5μmol/lLactacystin作用24h作為刺激條件。用不同濃度的含藥血清對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)保護(hù),與不同濃度的模型組相比,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示15%含藥血清保護(hù)24h、48h,細(xì)胞OD值及相對存活率顯著性增高(p0.01),而15%濃度含藥血清保護(hù)24h細(xì)胞OD值及相對存活率高于48h。本著相對存活率最高的最低血清濃度的原則,最終選用15%濃度含藥血清保護(hù)24h作為最佳條件。3.各組血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞活性的影響通過MTT檢測模型組細(xì)胞活性情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):模型組與吐溫80組之間細(xì)胞OD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);模型組和吐溫組細(xì)胞OD值顯著低于正常對照組(p0.01)。獨(dú)活香豆素組細(xì)胞OD值高于模型組(p0.01)、吐溫80組(p0.01)和塞來昔布組(p0.01),但低于正常對照組(p0.01);塞來昔布組細(xì)胞OD值高于模型組(p0.01)和吐溫80組(p0.01),但低于正常對照組(p0.01)和獨(dú)活香豆素組(p0.01)。4.各組血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響4.1Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示:模型組與吐溫80組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);與正常對照組相比,模型組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均顯著升高(p0.01)。4.2塞來昔布對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示:塞來昔布組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均低于模型組(p0.01),而細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均高于獨(dú)活香豆素組(p0.01)。4.3獨(dú)活香豆素對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示:獨(dú)活香豆素組與模型組相比,細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均顯著下降(p0.01),與塞來昔布組相比IL-1β、TNF-α蛋白的含量和細(xì)胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均低于塞來昔布組(p0.01)。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Lactacystin蛋白酶體抑制劑,成功模擬出帕金森病神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型。模型組神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞活性下降,炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)均升高。2.獨(dú)活香豆素含藥血清能促進(jìn)Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞增殖;且獨(dú)活香豆素含藥血清能夠下調(diào)Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)。3.獨(dú)活香豆素含藥血清對Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用,與其下調(diào)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá),抑制Lactacystin誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2690863