【摘要】：目的:隨著我國老齡人口的增加,老年癡呆發(fā)病人數(shù)日益增多,帶來嚴重的醫(yī)療、社會和經濟負擔。慢性腦低灌注(CCH)是包括老年癡呆等神經退行性病變的重要誘因之一。盡管對CCH導致認知損傷發(fā)病機理研究的逐漸深入,目前臨床對老年癡呆的預防和治療缺乏有效的藥物,需要尋找新的治療思路和藥物。CCH所致認知損傷的進展是多靶點的交互影響,研究針對單一靶點的治療尚未收到令人滿意的療效。中醫(yī)藥復方具有多靶點干預、整體調節(jié)疾病病理的作用。因此,有必要研究具有治療CCH相關認知功能障礙作用的神經保護類中藥,探討中藥多靶點的干預作用,為癡呆的防治提供新思路。加減薯蕷丸臨床應用于老年癡呆的治療取得較好療效,動物實驗證實其具有改善CCH所致認知功能損傷的作用,因此本研究將進一步研究加減薯蕷丸的作用機理,探討加減薯蕷丸對慢性腦低灌注模型大鼠阿爾茨海默樣病理改變的作用,從該方對能量調節(jié)和應激信號介導的自噬角度探討其對β淀粉樣物質(Amyloid beta,Aβ)沉積的作用機制,并從對microRNA-132信號的調節(jié)角度探討其對Tau蛋白磷酸化的作用機制。初步闡明加減薯蕷丸改善CCH所致阿爾茨海默樣病理改變的機制,為中醫(yī)藥臨床推廣應用提供理論支持。方法:選取Wistar雄性大鼠60只隨機分為4組,分別是正常組、模型組、西藥組和中藥組,每組15只。除正常組外,其余各組大鼠均進行雙側頸總動脈分次結扎并剪斷(改良2VO法),制作慢性腦低灌注大鼠模型,造模后第7天開始灌胃。中藥組每日灌胃給予加減薯蕷丸(10 g/kg);西藥組每日灌胃給予尼莫地平(10 g/kg);模型組及正常組給予相同劑量生理鹽水,各組連續(xù)給藥4周。4周后行Morris水迷宮行為學檢測,觀察慢性腦低灌注大鼠學習記憶能力。行為學檢測結束后,犧牲大鼠取全腦切片蘇木素-伊紅染色(HE)觀察組織病理改變,尼氏染色(NISSL)觀察神經元尼氏體水平,原位末端標記檢測(TUNEL)神經元凋亡情況;取海馬CA1區(qū)新鮮組織3mm~3,固定包埋制作超薄切片,鈾鉛雙染色后透射電鏡觀察海馬神經細胞內自噬小體形成;免疫組化檢測LC3B、Aβ42、AMPK、p-AMPK、eIF2α、ATF4;qRT-PCR檢測microRNA-132及eIF2α、ATF4、GSK-3βmRNA水平;Western blot檢測eIF2α、ATF4、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Tau、p-Tau、GSK-3β蛋白水平。結果:1.Morris水迷宮檢測:在逃避潛伏期,第1天和第2天模型組與西藥組和中藥組所花時間無明顯差異,到第3天西藥組和中藥組與模型組的逃避潛伏期出現(xiàn)明顯差別(P0.05),至第4天中藥組、西藥組和模型組的逃避潛伏期的時間均減少,西藥組顯示出最接近正常組的逃避潛伏時間。第5天進行水迷宮空間探索實驗結果顯示,四組大鼠的游泳速度無明顯差異,正常組大鼠會在原平臺區(qū)域來回游動穿梭或者停留,在平臺區(qū)域停留時間比例增加,穿越平臺次數(shù)多。與正常組相比,模型組大鼠的原平臺停留時間及穿越次數(shù)明顯減少(P0.05),西藥組和中藥組大鼠經過藥物干預后,原平臺停留時間比例及穿越次數(shù)均較模型組有明顯增加(P0.05)。2.HE染色:正常組大鼠海馬CA1區(qū)神經元結構完整、排列整齊、核染色清晰,而2VO后的模型組大鼠海馬出現(xiàn)神經細胞數(shù)量減少、排列疏松、核固縮等神經病理性改變;在中藥和西藥干預后,海馬組織病理結果有所改善,神經細胞數(shù)量增多、排列較為規(guī)則,提示加減薯蕷丸對CCH大鼠海馬區(qū)神經元具有保護作用。3.NISSL染色:正常組大鼠海馬神經細胞內含有較多的尼氏體,2VO慢性腦低灌注后模型組大鼠海馬尼氏體數(shù)量減少,經中藥及西藥干預,尼氏體數(shù)量有所恢復。4.TUNEL染色:正常組海馬CA1區(qū)TUNEL熒光染色神經細胞數(shù)量較少,提示凋亡神經元較少;模型組海馬CA1區(qū)TUNEL熒光染色神經細胞數(shù)量明顯增多,提示凋亡神經細胞數(shù)量增多;經藥物干預4周后,西藥組和中藥組海馬CA1區(qū)TUNEL染色減少。5.透射電鏡:在正常組神經細胞中,未觀察到形成自噬小體,模型組電鏡下可見大量自噬小體,形態(tài)多樣,包括可見正在包裹胞漿成分的自噬小體;中藥組和西藥組中也可以觀察到自噬小體的出現(xiàn)。6.實時熒光定量PCR檢測:CCH后大鼠海馬CA1區(qū)ATF4、eIF2αmRNA表達水平顯著升高(P0.001);中藥和西藥干預后,ATF4、eIF2αmRNA表達水平降低;慢性腦低灌注后大鼠海馬microRNA-132水平顯著降低(P0.001),GSK-3βmRNA水平顯著升高(P0.001);中藥和西藥干預后,microRNA-132水平升高(P0.01),GSK-3βmRNA水平降低(P0.01)。7.Western blot檢測:AMPK、Tau蛋白表達無顯著差異。與正常組相比,模型組經CCH后p-AMPK的蛋白表達顯著增加(P0.01),ATF4、eIF2α的蛋白表達顯著增加(P0.001),模型組LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P0.01),GSK-3β和p-Tau(Ser396)蛋白水平升高,但不影響Tau蛋白的水平;中藥和西藥干預后,p-AMPK的蛋白水平降低,ATF4、eIF2α的蛋白水平降低,LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值降低,GSK-3β和p-Tau(Ser396)蛋白水平降低。8.免疫組化檢測:與正常組相比,模型組經慢性低灌注誘導后p-AMPK表達顯著升高(P0.01),ATF4、eIF2α的蛋白表達顯著升高(P0.001),Aβ42沉積和LC3B均顯著升高,可見神經炎性斑沉積;中藥和西藥干預后,p-AMPK降低,ATF4、eIF2α降低,Aβ42沉積和LC3B降低,中藥組與西藥組見無顯著差異。結論:1.加減薯蕷丸調節(jié)能量應激介導的自噬,減少CCH大鼠海馬Aβ沉積。2.加減薯蕷丸調節(jié)miR-132/GSK-3β信號,抑制CCH大鼠海馬Tau磷酸化。
【圖文】：

湖北中醫(yī)藥大學 2018 屆博士學位論文臺次數(shù)。結果顯示，去除原平臺后，四組大鼠的游泳速度無明顯差異（見圖 1 b），，正常組大鼠會在原平臺區(qū)域來回游動穿梭或者停留，在平臺區(qū)域停留時間比例長，穿越平臺次數(shù)多；與正常組相比，模型組大鼠的原平臺停留時間及穿越次數(shù)明顯減少（P<0.05），西藥組和中藥組大鼠經過藥物干預后，原平臺停留時間比例及穿越次數(shù)均較模型組有明顯改善（P<0.05）。（見圖 1 c & d）

加減薯蕷丸對慢性腦低灌注致阿爾茨海默樣病理改變作用的研究大鼠海馬區(qū)神經元具有保護作用。（見圖 2 a 中 HE 染色）Nissl 染色結果提示，正常組大鼠海馬神經元含有具有較多的尼氏體，2VO 慢性腦低灌注后模型組大鼠海馬尼氏體數(shù)量減少，經中藥及西藥干預，尼氏體數(shù)量有所恢復，提示加減薯蕷丸具有保護慢性腦低灌注所致海馬神經細胞尼氏體損傷的作用。（見圖 2 a & b）
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 王玉;呂美娟;任路;;從痰瘀機制探討自噬與輕度認知障礙的關系[J];中華中醫(yī)藥學刊;2017年12期

2 高曉宇;張哲;王洋;劉悅;孔德昭;孟繁麗;潘嘉祥;唐晶;李佳;尹妮;楊關林;;基于脾虛生痰理論探討巨噬細胞自噬與動脈粥樣硬化的關系[J];中醫(yī)雜志;2017年22期

3 譚子虎;陳延;劉茜;祝媛s

本文編號：2690320