【摘要】：目的:青藤堿是從防己科植物青藤等植物中提取的生物堿,具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、局麻、免疫抑制、抗炎和抗腫瘤等作用,近年來發(fā)現(xiàn)青藤堿也具有缺血再灌注損傷的保護(hù)功效。本課題通過建立小鼠腎缺血再灌注模型,從腎功能、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和microRNA的調(diào)節(jié)等方面,研究青藤堿對缺血再灌注腎臟保護(hù)的機制。方法:建立小鼠腎缺血再灌注模型,于再灌注前1h小鼠腹腔注射青藤堿(sinomenine,SIN)(200 mg/kg),假手術(shù)組(Sham)和缺血再灌注組(I/R)腹腔注射等容量生理鹽水。全自動生化儀檢測小鼠血清Cr和BUN濃度;應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定小鼠腎組織SOD活性;髓過氧化酶法測定小鼠腎組織MPO活性;硫代巴比妥法測定小鼠腎組織MDA含量;應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法檢測腎組織細(xì)胞凋亡。礦物油覆蓋細(xì)胞法建立HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)細(xì)胞模型。MTT法檢測青藤堿處理HK-2細(xì)胞H/R后的活性,流式細(xì)胞儀檢測不同濃度青藤堿處理HK-2細(xì)胞H/R后的凋亡。根據(jù)文獻(xiàn)確立miR-21、miR-320、miR-124、miR-92a、miR-29和miR-378為候選miRNA,通過實時定量PCR檢測HK-2細(xì)胞H/R后這些miRNA的表達(dá)。利用TargetScan對miR-124靶基因進(jìn)行分析預(yù)測,通過雙熒光素酶報告基因檢測法檢測miR-124與靶基因Caspase-9的結(jié)合。Westblot檢測miR-124 mimic與inhibitor轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,HK-2細(xì)胞H/R后Caspase-9的表達(dá)。結(jié)果:1.與Sham組比較,I/R組和SIN組在腎缺血再灌注8h和24h時,血清Cr和BUN濃度均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與I/R組比較,SIN+I/R組在腎缺血再灌注8h和24h時血清Cr和BUN濃度均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2.與Sham組比較,I/R組和SIN組在腎缺血再灌注8h和24h時,腎臟組織細(xì)胞凋亡率、MDA濃度與MPO活性均升高,而SOD活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與I/R組比較,SIN+I/R組在缺血再灌注8h和24h時腎臟組織細(xì)胞凋亡率、MDA濃度與MPO活性均降低,而SOD活性升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.與H/R 24h HK-2細(xì)胞對照組比較,各濃度的SIN+H/R組HK-2細(xì)胞活性均升高,細(xì)胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.HK-2細(xì)胞H/R 24h后的miR-21、mi R-29和miR-378的表達(dá)上調(diào),miR-320、miR-124和miR-92a表達(dá)下調(diào),與對照組比較,miR-378表達(dá)明顯上調(diào),而miR-124表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。H/R導(dǎo)致HK-2細(xì)胞miR-124表達(dá)隨著H/R時間延長,miR-124表達(dá)逐漸降低,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.當(dāng)用青藤堿處理H/R的HK-2細(xì)胞,HK-2細(xì)胞的miR-124表達(dá)會隨著藥物濃度的增大而上升;與H/R對照組比較,除0.1μM濃度外,其它濃度的SIN+H/R組24h的HK-2細(xì)胞的miR-124表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.當(dāng)miR-124 mimic轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,與NC比較,miR-124表達(dá)明顯升高,而inhibitor轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后,與NC比較,miR-124表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。7.與對照組比較,pGL 3’-WT Caspase 9 3’-UTR+miR-124 mimic組Caspase 9表達(dá)很低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),而pGL 3’-WT Caspase 9 3’-UTR+miR-124inhibitor組Caspase 9表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與對照組比較,Mut Caspase 9 3’-UTR各組Caspase 9表達(dá)無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)。8.與對照組比較,當(dāng)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic后,Caspase-9表達(dá)顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而當(dāng)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor后,與對照組比較,Caspase-9表達(dá)顯著增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。9.青藤堿(50μM)能提高H/R HK-2細(xì)胞活性而降低細(xì)胞凋亡率,但當(dāng)miR-124 inhibitor抑制HK-2細(xì)胞miR-124表達(dá)后,SIN+mi R-124 inhibitor組H/R HK-2細(xì)胞活性降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高。與SIN組比較,SIN+miR-124 inhibitor組H/R 24h后HK-2細(xì)胞活性明顯降低而細(xì)胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:青藤堿可減輕小鼠腎缺血再灌注的組織損傷,其機制與青藤堿抑制氧化損傷和降低腎臟細(xì)胞凋亡率有關(guān)。H/R后的HK-2細(xì)胞的miR-124表達(dá)明顯下調(diào),說明miR-124與HK-2細(xì)胞H/R有關(guān)。miR-124通過與Caspase 9 3’-UTR結(jié)合,從而下調(diào)Caspase-9的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。青藤堿可減輕缺氧/復(fù)氧后HK-2細(xì)胞的損傷,其機制與青藤堿誘導(dǎo)miR-124的上調(diào),抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)程有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2690260