【摘要】：牛樟芝是一種名貴的藥用菌類,含有多種藥理活性成分,包括萜類化合物、多糖、蛋白、苯醌類、芳香類、脂類等,具有保肝護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力和治療腫瘤等多種神奇功效,具有極高的研究?jī)r(jià)值。黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞,是合成和分泌黑色素的樹(shù)突狀細(xì)胞。資料表明,黑素細(xì)胞除合成和分泌黑色素外,還參與皮膚免疫過(guò)程。黑素細(xì)胞功能異常會(huì)引起白化、白癜風(fēng)等多種疾病。本研究采用原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞和市售牛樟芝提取物,從細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞凋亡、因子水平、黑色素合成率和細(xì)胞遷移等方面,探究牛樟芝對(duì)黑素細(xì)胞的活性和功能的影響。方法:1.原代細(xì)胞提取,參照公開(kāi)發(fā)表的方法,選用兒童包皮組織利用酶消化法去除無(wú)關(guān)組織,篩選純化黑素細(xì)胞。將獲取的黑素細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),并進(jìn)行左旋多巴染色和免疫吸附驗(yàn)證。2.活性研究:利用MTT法檢測(cè)牛樟芝提取物對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響,建立多巴胺體外誘導(dǎo)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡模型,并依據(jù)此凋亡模型檢測(cè)牛樟芝提取物對(duì)黑素細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。3.功能研究:使用Elisa試劑盒法檢測(cè)牛樟芝對(duì)黑素細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子水平的影響,采用多巴胺反應(yīng)速率法檢測(cè)牛樟芝對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響。利用NaOH裂解黑素細(xì)胞檢測(cè)黑色素合成量,檢測(cè)并計(jì)算牛樟芝對(duì)黑色素合成率的影響。最后,用Transwell小室法檢測(cè)牛樟芝提取物對(duì)黑素細(xì)胞遷移作用的影響。結(jié)果:1.左旋多巴染色和免疫吸附驗(yàn)證結(jié)果顯示,本研究成功提取純化了人原代黑素細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)一,突起相互連接,鑒定結(jié)果顯示染色純度較高,未見(jiàn)角質(zhì)細(xì)胞污染。2.MTT結(jié)果顯示,牛樟芝能夠顯著促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,并對(duì)氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞凋亡有顯著抑制作用。3.功能研究結(jié)果顯示,牛樟芝能夠降低黑素細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子分泌,提高酪氨酸酶活性,提升黑色素合成,促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移。結(jié)論:本研究成功提取并純化了人黑素原代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明,牛樟芝提取物能夠促進(jìn)人黑素細(xì)胞增殖,并對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。此外牛樟芝提取物還能夠降低黑素細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子水平,提高黑色素合成率,促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移,為牛樟芝治療白癜風(fēng)提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 4.1 原代黑素細(xì)胞第 3 代細(xì)胞鏡下觀察形態(tài)圖注： Bar=20μm.4.4.2 黑素細(xì)胞鑒定結(jié)果左旋多巴又稱左多巴，，由酪氨酸形成兒茶酚胺反應(yīng)的中間產(chǎn)物，同時(shí)也是種抗震顫麻痹藥物。在人體毛發(fā)黑色素形成過(guò)程中就有左旋多巴的存在，左旋巴與金屬離子經(jīng)氧化反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)棕黑色，因此左旋多巴在染發(fā)行業(yè)廣為使用Giemsa 染料包含兩種物質(zhì)，分別為 May-Grunwald 染料和 Giemsa 染料May-Grunwald 即曙紅亞甲基藍(lán)Ⅱ，對(duì)細(xì)胞質(zhì)親和性較好，能將細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)至棕色，Giemsa 則主要親和細(xì)胞核，將細(xì)胞核區(qū)域染成褐色。兩者相互輔助在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。經(jīng)左旋多巴處理和 Giemsa 染色鑒定，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)自然，沒(méi)有縮和凝聚現(xiàn)象。胞體圓潤(rùn)，樹(shù)突長(zhǎng)而圓滑，細(xì)胞質(zhì)及樹(shù)突被染料染成棕藍(lán)色，胞核區(qū)域被染成棕褐色(如圖 4.2 所示)。

圖 4.2 原代黑素細(xì)胞 L-Dopa 染色結(jié)果圖注： Bar=10μm.如圖 4.3 所示，培養(yǎng)的原代細(xì)胞著色明顯，細(xì)胞突起和胞質(zhì)染成棕黃色，胞內(nèi) S-100 蛋白表達(dá)水平較高，符合人黑素細(xì)胞的特征。鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)正常，所有細(xì)胞幾乎全部著色，表明所培養(yǎng)的原代細(xì)胞為高純度的黑素細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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