【摘要】：牛樟芝是一種名貴的藥用菌類,含有多種藥理活性成分,包括萜類化合物、多糖、蛋白、苯醌類、芳香類、脂類等,具有保肝護肝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗氧化、調節(jié)免疫力和治療腫瘤等多種神奇功效,具有極高的研究價值。黑素細胞起源于神經(jīng)嵴細胞,是合成和分泌黑色素的樹突狀細胞。資料表明,黑素細胞除合成和分泌黑色素外,還參與皮膚免疫過程。黑素細胞功能異常會引起白化、白癜風等多種疾病。本研究采用原代培養(yǎng)的黑素細胞和市售牛樟芝提取物,從細胞生長增殖、細胞凋亡、因子水平、黑色素合成率和細胞遷移等方面,探究牛樟芝對黑素細胞的活性和功能的影響。方法:1.原代細胞提取,參照公開發(fā)表的方法,選用兒童包皮組織利用酶消化法去除無關組織,篩選純化黑素細胞。將獲取的黑素細胞進行傳代培養(yǎng),并進行左旋多巴染色和免疫吸附驗證。2.活性研究:利用MTT法檢測牛樟芝提取物對黑素細胞增殖的影響,建立多巴胺體外誘導黑素細胞氧化應激凋亡模型,并依據(jù)此凋亡模型檢測牛樟芝提取物對黑素細胞凋亡的保護作用。3.功能研究:使用Elisa試劑盒法檢測牛樟芝對黑素細胞促炎性細胞因子水平的影響,采用多巴胺反應速率法檢測牛樟芝對黑素細胞酪氨酸酶活性的影響。利用NaOH裂解黑素細胞檢測黑色素合成量,檢測并計算牛樟芝對黑色素合成率的影響。最后,用Transwell小室法檢測牛樟芝提取物對黑素細胞遷移作用的影響。結果:1.左旋多巴染色和免疫吸附驗證結果顯示,本研究成功提取純化了人原代黑素細胞。鏡下觀察細胞形態(tài)統(tǒng)一,突起相互連接,鑒定結果顯示染色純度較高,未見角質細胞污染。2.MTT結果顯示,牛樟芝能夠顯著促進黑素細胞增殖,并對氧化應激引發(fā)的細胞凋亡有顯著抑制作用。3.功能研究結果顯示,牛樟芝能夠降低黑素細胞促炎性細胞因子分泌,提高酪氨酸酶活性,提升黑色素合成,促進黑素細胞遷移。結論:本研究成功提取并純化了人黑素原代細胞。實驗證明,牛樟芝提取物能夠促進人黑素細胞增殖,并對氧化應激誘導的黑素細胞凋亡有保護作用。此外牛樟芝提取物還能夠降低黑素細胞促炎性細胞因子水平,提高黑色素合成率,促進黑素細胞遷移,為牛樟芝治療白癜風提供理論基礎。
【圖文】：

圖 4.1 原代黑素細胞第 3 代細胞鏡下觀察形態(tài)圖注： Bar=20μm.4.4.2 黑素細胞鑒定結果左旋多巴又稱左多巴，，由酪氨酸形成兒茶酚胺反應的中間產(chǎn)物，同時也是種抗震顫麻痹藥物。在人體毛發(fā)黑色素形成過程中就有左旋多巴的存在，左旋巴與金屬離子經(jīng)氧化反應會呈現(xiàn)棕黑色，因此左旋多巴在染發(fā)行業(yè)廣為使用Giemsa 染料包含兩種物質，分別為 May-Grunwald 染料和 Giemsa 染料May-Grunwald 即曙紅亞甲基藍Ⅱ，對細胞質親和性較好，能將細胞質染成藍至棕色，Giemsa 則主要親和細胞核，將細胞核區(qū)域染成褐色。兩者相互輔助在細胞生物學實驗中應用廣泛。經(jīng)左旋多巴處理和 Giemsa 染色鑒定，鏡下觀察可見細胞形態(tài)自然，沒有縮和凝聚現(xiàn)象。胞體圓潤，樹突長而圓滑，細胞質及樹突被染料染成棕藍色，胞核區(qū)域被染成棕褐色(如圖 4.2 所示)。

圖 4.2 原代黑素細胞 L-Dopa 染色結果圖注： Bar=10μm.如圖 4.3 所示，培養(yǎng)的原代細胞著色明顯，細胞突起和胞質染成棕黃色，胞內 S-100 蛋白表達水平較高，符合人黑素細胞的特征。鏡下觀察可見細正常，所有細胞幾乎全部著色，表明所培養(yǎng)的原代細胞為高純度的黑素細胞
【學位授予單位】：齊魯工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2688920