【摘要】：目的:基于代謝組學等研究藍布正水提物及沒食子酸抗環(huán)磷酰胺(CP)致AML12細胞損傷的保護效應及作用機制。方法:建立高效液相色譜法同時測定藍布正藥材中沒食子酸和鞣花酸含量的方法,并對方法學進行驗證。建立CP致AML12細胞損傷模型并探討藍布正水提物及沒食子酸對細胞存活率的影響;再從細胞形態(tài)觀察、肝功酶、抗凋亡、抗氧化研究藍布正水提取物及沒食子酸對AML12細胞損傷模型的綜合保護效應;采用實時熒光定量核酸擴增檢測(RT-qPCR)、蛋白印跡法(WB)研究藍布正水提物及沒食子酸對氧化和凋亡相關基因的表達的影響。建立反相高效液相色譜-串聯(lián)質譜(RPLC-MS/MS)分析肝細胞破碎液的代謝組學方法,對不同組別進行代謝輪廓分析,模式識別差異代謝物,分析其關聯(lián)的代謝通路來初步闡釋其作用機制。結果:建立了同時測定藍布正藥材中沒食子酸和鞣花酸的含量的方法,線性、儀器精密度、方法重復性、24 h內穩(wěn)定性均良好、準確度高。6批藥材測得沒食子酸和鞣花酸的平均含量分別為0.033%、0.192%。與正常對照組相比,CP模型組AML12細胞存活率明顯下降;ALT、AST、LDH肝功酶含量顯著升高(P0.05);細胞凋亡顯著增加(P0.05);SOD、MDA含量顯著升高(P0.05),GSH含量顯著降低(P0.05)。與CP模型組相比,藍布正水提物和沒食子酸給藥后,可提高AML12細胞存活率;降低了細胞上清中的ALT、AST、LDH含量;抑制AML12細胞凋亡(P0.05);升高了細胞破碎液中SOD、GSH含量水平(P0.05),降低了MDA含量水平(P0.05)。在代謝組學分析中,本研究發(fā)現(xiàn)藍布正水提物調節(jié)Niflumic acid、Palmitoylethanolamide、4-oxo-Retinoic acid等6個代謝物,主要涉及氨基酸代謝和花生四烯酸代謝。沒食子酸主要調節(jié)L-Threo-3-Phenylserine、L-Leucine、Met His Lys等17個代謝物,主要涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、鞘脂代謝等代謝通路。RT-qPCR法測定凋亡和氧化應激基因,與正常對照組相比,CP模型組Bad、Bax、caspase3、caspase9、P53的m RNA水平明顯上調(P0.05),Bcl-2、Keap1、Nqo1的mRNA水平下調(P0.05);與CP模型組相比,藍布正水提物及沒食子酸干預后可下調Bad、Bax、caspase3、caspase9、P53的mRNA水平(P0.05),升高Bcl-2、HO-1、Keap1、Nqo1、Nrf-2的mRNA水(P0.05)。同時WB法測定結果中,與正常對照組相比,CP模型組Bax的蛋白水平上調(P0.05),Bcl-2的蛋白水平明顯下調(P0.05);與CP模型組相比,藍布正水提物及沒食子酸給藥后可下調Bax的蛋白水平(P0.05),升高Bcl-2的蛋白水平(P0.05)。結論:藍布正水提物和沒食子酸可減輕CP致AML12細胞損傷,機制與改善細胞功能,減少細胞凋亡,抗氧化應激及調節(jié)細胞代謝網絡等有關。
【圖文】：

圖 1-1 藍布正供試品和藍布正水提物 HPLCA.空白溶劑 B.對照品溶液 C.供試品溶液 D.藍布正水提物供試品溶液 1.沒食子酸 2.鞣花酸2.2 標準曲線的繪制以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到的線性回歸方程為：Y沒食子酸=11.703X-2.012（r=0.9999），Y鞣花酸=15.033X-32.982（r=0.9995）。結果表明沒食子酸和鞣花酸分別在 2.41~54.11，5.28~118.69 μg/mL 呈良好的線性。

圖 1-2 沒食子酸和鞣花酸標準曲線A.沒食子酸 B.鞣花酸2.3 精密度試驗如表 1-1，沒食子酸、鞣花酸峰面積的 RSD 分別為 1.44%、1.29%，表明儀器精密度良好。表 1-1 沒食子酸和鞣花酸精密度的考察結果序號 沒食子酸峰面積 鞣花酸峰面積1 633.10 1769.802 649.10 1778.403 652.50 1758.404 652.20 1782.205 635.10 1721.60
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2687865