【摘要】：目的:基于代謝組學(xué)等研究藍(lán)布正水提物及沒食子酸抗環(huán)磷酰胺(CP)致AML12細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)及作用機(jī)制。方法:建立高效液相色譜法同時(shí)測定藍(lán)布正藥材中沒食子酸和鞣花酸含量的方法,并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。建立CP致AML12細(xì)胞損傷模型并探討藍(lán)布正水提物及沒食子酸對(duì)細(xì)胞存活率的影響;再從細(xì)胞形態(tài)觀察、肝功酶、抗凋亡、抗氧化研究藍(lán)布正水提取物及沒食子酸對(duì)AML12細(xì)胞損傷模型的綜合保護(hù)效應(yīng);采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(RT-qPCR)、蛋白印跡法(WB)研究藍(lán)布正水提物及沒食子酸對(duì)氧化和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)的影響。建立反相高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(RPLC-MS/MS)分析肝細(xì)胞破碎液的代謝組學(xué)方法,對(duì)不同組別進(jìn)行代謝輪廓分析,模式識(shí)別差異代謝物,分析其關(guān)聯(lián)的代謝通路來初步闡釋其作用機(jī)制。結(jié)果:建立了同時(shí)測定藍(lán)布正藥材中沒食子酸和鞣花酸的含量的方法,線性、儀器精密度、方法重復(fù)性、24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好、準(zhǔn)確度高。6批藥材測得沒食子酸和鞣花酸的平均含量分別為0.033%、0.192%。與正常對(duì)照組相比,CP模型組AML12細(xì)胞存活率明顯下降;ALT、AST、LDH肝功酶含量顯著升高(P0.05);細(xì)胞凋亡顯著增加(P0.05);SOD、MDA含量顯著升高(P0.05),GSH含量顯著降低(P0.05)。與CP模型組相比,藍(lán)布正水提物和沒食子酸給藥后,可提高AML12細(xì)胞存活率;降低了細(xì)胞上清中的ALT、AST、LDH含量;抑制AML12細(xì)胞凋亡(P0.05);升高了細(xì)胞破碎液中SOD、GSH含量水平(P0.05),降低了MDA含量水平(P0.05)。在代謝組學(xué)分析中,本研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)布正水提物調(diào)節(jié)Niflumic acid、Palmitoylethanolamide、4-oxo-Retinoic acid等6個(gè)代謝物,主要涉及氨基酸代謝和花生四烯酸代謝。沒食子酸主要調(diào)節(jié)L-Threo-3-Phenylserine、L-Leucine、Met His Lys等17個(gè)代謝物,主要涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、鞘脂代謝等代謝通路。RT-qPCR法測定凋亡和氧化應(yīng)激基因,與正常對(duì)照組相比,CP模型組Bad、Bax、caspase3、caspase9、P53的m RNA水平明顯上調(diào)(P0.05),Bcl-2、Keap1、Nqo1的mRNA水平下調(diào)(P0.05);與CP模型組相比,藍(lán)布正水提物及沒食子酸干預(yù)后可下調(diào)Bad、Bax、caspase3、caspase9、P53的mRNA水平(P0.05),升高Bcl-2、HO-1、Keap1、Nqo1、Nrf-2的mRNA水(P0.05)。同時(shí)WB法測定結(jié)果中,與正常對(duì)照組相比,CP模型組Bax的蛋白水平上調(diào)(P0.05),Bcl-2的蛋白水平明顯下調(diào)(P0.05);與CP模型組相比,藍(lán)布正水提物及沒食子酸給藥后可下調(diào)Bax的蛋白水平(P0.05),升高Bcl-2的蛋白水平(P0.05)。結(jié)論:藍(lán)布正水提物和沒食子酸可減輕CP致AML12細(xì)胞損傷,機(jī)制與改善細(xì)胞功能,減少細(xì)胞凋亡,抗氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)等有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 藍(lán)布正供試品和藍(lán)布正水提物 HPLCA.空白溶劑 B.對(duì)照品溶液 C.供試品溶液 D.藍(lán)布正水提物供試品溶液 1.沒食子酸 2.鞣花酸2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到的線性回歸方程為：Y沒食子酸=11.703X-2.012（r=0.9999），Y鞣花酸=15.033X-32.982（r=0.9995）。結(jié)果表明沒食子酸和鞣花酸分別在 2.41~54.11，5.28~118.69 μg/mL 呈良好的線性。

圖 1-2 沒食子酸和鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線A.沒食子酸 B.鞣花酸2.3 精密度試驗(yàn)如表 1-1，沒食子酸、鞣花酸峰面積的 RSD 分別為 1.44%、1.29%，表明儀器精密度良好。表 1-1 沒食子酸和鞣花酸精密度的考察結(jié)果序號(hào) 沒食子酸峰面積 鞣花酸峰面積1 633.10 1769.802 649.10 1778.403 652.50 1758.404 652.20 1782.205 635.10 1721.60
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2687865