發(fā)布時(shí)間：2020-05-30 09:47

【摘要】：目的:探討白藜蘆醇對(duì)NIH3T3細(xì)胞Shh信號(hào)通路的影響及其可能分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)小鼠NIH3T3細(xì)胞。(1)探討不同濃度白藜蘆醇對(duì)饑餓24h的NIH3T3細(xì)胞活力的影響。實(shí)驗(yàn)分為3組:對(duì)照組(Ctrl),白藜蘆醇組(白藜蘆醇0.1、0.5、1、5、10、20、40、80μmol/L,Res0.1、Res0.5、Res 1、Res5、Res 10、Res 20、Res 40、Res 80),空白組(Blank)。(2)探討Shh信號(hào)通路在白藜蘆醇影響NIH3T3細(xì)胞活力中的作用。實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(Ctrl),白藜蘆醇組(Resl),Shh信號(hào)通路Smo受體抑制劑環(huán)王巴明組(cyclopamine,Cyc),白藜蘆醇+環(huán)王巴明組(Resl+Cyc),空白組(Blank)。(3)探討Sirt1是否影響Shh信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)分為6組:對(duì)照組(Ctrl),白藜蘆醇組(Res1),Sirt1 激動(dòng)劑 SRT1720 組(SRT),Sirt1抑制劑Sirtino1組(Sirtino1),重組小鼠Shh蛋白組(Shh),空白組(Blank)。CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力,免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀測(cè)Gli-1蛋白的核移位,Smo蛋白移位到初級(jí)纖毛。Western blotting檢測(cè)信號(hào)通路Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.白藜蘆醇對(duì)NIH3T3細(xì)胞活力影響的濃度效應(yīng)CCK-8 法顯示 0.5 和 1 μmol/L 白藜蘆醇組(0.679 ± 0.047,0.774 ±0.054)細(xì)胞活力分別較對(duì)照組(0.585 ± 0.039)明顯增強(qiáng)(P0.01,P0.001),其中以1 μmol/L白藜蘆醇組最強(qiáng)。之后隨白藜蘆醇濃度(10、20、40、80 μmol/L)的增高,細(xì)胞活力逐漸降低(0.428 ± 0.043,0.395 ±0.031,0.373 ±0.017,0.361 ± 0.016),且均較對(duì)照組明顯減弱(P=0.000,P0.001,P= 0.001,P= 0.001),而 0.1 μmol/L(0.602 ± 0.065)和 5 μmol/L組(0.556 ±0.041)細(xì)胞活力與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P0.05,P=0.05)。選1μmol/L白藜蘆醇組作進(jìn)一步研究。2.Shh信號(hào)介導(dǎo)白藜蘆醇影響NIH3T3細(xì)胞活力CCK-8法結(jié)果顯示,lumol/L白藜蘆醇組細(xì)胞活力(0.778±0.371)明顯高于對(duì)照組(0.563±0.034)(P0.05)。而環(huán)王巴明組(0.439±0.259)或環(huán)王巴明聯(lián)合白藜蘆醇組(0.602±0.179)細(xì)胞活力明顯低于白藜蘆醇組,且環(huán)王巴明組最低(P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示NIH3T3細(xì)胞存在一根初級(jí)纖毛。對(duì)照組Smo蛋白位于細(xì)胞漿,白藜蘆醇組Smo蛋白從細(xì)胞漿進(jìn)入初級(jí)纖毛,而環(huán)王巴明組或環(huán)王巴明聯(lián)合白藜蘆醇組,Smo蛋白仍位于細(xì)胞漿。同時(shí)對(duì)照組Gli-1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿,白藜蘆醇組Gli-1蛋白則明顯移位到細(xì)胞核,而環(huán)王巴明組或環(huán)王巴明聯(lián)合白藜蘆醇組,Gli-1蛋白仍位于細(xì)胞漿。Western blotting法顯示白藜蘆醇組Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.05),而環(huán)王巴明組或環(huán)王巴明聯(lián)合白藜蘆醇組Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯低于白藜蘆醇組,環(huán)王巴明組最低(P0.05)。3.Sirt1對(duì)NIH3T3細(xì)胞Shh信號(hào)的影響CCK-8 法結(jié)果顯示,lumol/L 白藜蘆醇(0.751±0.05),SRT1720(0.793±0.037)和Shh(0.838±0.418)組細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組(0.531±0.034)(P0.05),而 Sirtinol 組(0.448±0.030)細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照、白藜蘆醇、SRT1720和Shh組(P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示對(duì)照組Smo蛋白位于細(xì)胞漿,白藜蘆醇、SRT1720和Shh組Smo蛋白從細(xì)胞漿進(jìn)入初級(jí)纖毛,而Sirtinol組,Smo蛋白仍位于細(xì)胞漿。同時(shí),對(duì)照組Gli-1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿,白藜蘆醇、SRT1720和Shh組Gli-1蛋白則明顯移位到細(xì)胞核,而Sirtinol組Gli-1蛋白仍位于細(xì)胞漿。Western blotting 法顯示白藜蘆醇、SRT1720 和 Shh 組 Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.05),而Sirtinol組Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯低于對(duì)照、白藜蘆醇、SRT1720 和 Shh 組(P0.05)。結(jié)論:白藜蘆醇能通過(guò)Shh信號(hào)介導(dǎo)以增強(qiáng)NIH3T3細(xì)胞活力,并且Sirt1可能是Shh信號(hào)通路上游的調(diào)節(jié)劑。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2687952