【摘要】：阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease,AD)是一種增齡性神經(jīng)退行性疾病,是老齡化社會(huì)的重要疾病,目前尚無(wú)有效治療藥物。AD的特征性病理改變是β淀粉樣蛋白(Aβ)累積形成的腦內(nèi)老年斑塊繼發(fā)引起廣泛的神經(jīng)損傷。Aβ由39-43個(gè)氨基酸組成,Aβ42極易聚集形成引起AD病理改變的不溶性淀粉樣斑塊。Aβ42從產(chǎn)生到凝集,是引起AD氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)毒性、膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng),間接參與Tau蛋白過(guò)磷酸化過(guò)程的始動(dòng)動(dòng)環(huán)節(jié)。抑制Aβ42的積聚,是AD藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。桑黃是一種有價(jià)值的藥用真菌,作為天然藥物毒副作用小且有廣泛的生物活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等。本實(shí)驗(yàn)室前期工作篩選了多種天然單體組分,發(fā)現(xiàn)菌類(lèi)桑黃活性成分單體組分P具有抑制Aβ42聚積的可能。所以,本項(xiàng)目旨在系統(tǒng)研究桑黃總組分和單體組分P對(duì)Aβ42分子聚積的抑制作用和對(duì)AD模型鼠腦內(nèi)老年斑積聚的拮抗作用,為可能的藥物研發(fā)提供依據(jù)。首先我們從生物信息學(xué)出發(fā),應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接軟件Autodock4.2對(duì)菌類(lèi)組分P分子與Aβ42單體、寡聚體和纖維體的結(jié)合情況進(jìn)行模擬,發(fā)現(xiàn)菌類(lèi)組分P與單體Aβ42的29位甘氨酸和32位異亮氨酸的結(jié)合能釋放分別為8.27kcal/mol和8.74kcal/mol,與Aβ42寡聚體的結(jié)合位點(diǎn)為17位異亮氨酸和相鄰Aβ42分子的38位甘氨酸,結(jié)合能釋放7.58kcal/mol。分析預(yù)測(cè)結(jié)果表明菌類(lèi)組分P分子極可能對(duì)Aβ42聚集有影響。然后,我們通過(guò)Aβ42肽的人神經(jīng)瘤母細(xì)胞SH-SY5Y損傷實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平上探究了桑黃總組分和單體組分P對(duì)Aβ42肽積聚介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。通過(guò)MTT法,尋找對(duì)神經(jīng)瘤母細(xì)胞(SH-SY5Y)的造成損傷的Aβ42最適毒性濃度及作用時(shí)間,我們建立了Aβ42終濃度1μM、作用時(shí)間為3h的SH-SY5Y損傷模型。進(jìn)而通過(guò)桑黃總組分和單體組分P與Aβ42肽孵育后,加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,發(fā)現(xiàn)菌類(lèi)組分P和桑黃可以明顯地抑制Aβ42寡聚體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。接下來(lái),我們通過(guò)分子克隆實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了PCDNA3.1-Flag-Aβ42和PCDNA3.1-Myc-Aβ42真核質(zhì)粒。利用兩個(gè)重組質(zhì)粒,我們通過(guò)免疫共沉降實(shí)驗(yàn)證明了Flag-Aβ42和MYC-Aβ42兩個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用,而桑黃組分和單體組分P可以減弱抑制兩者的相互結(jié)合,證明桑黃組分和單體組分P干預(yù)了Aβ的聚集過(guò)程。在體外實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上,我們通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桑黃組分和單體組分P對(duì)AD鼠腦內(nèi)老年斑積聚的拮抗作用。以國(guó)際公認(rèn)的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,我們將八月齡AD模型小鼠32只劃分為對(duì)照組、安理申組、桑黃組、菌類(lèi)組分P組,每組8只,分別灌胃生理鹽水、安理申、桑黃、菌類(lèi)組分P兩個(gè)月。灌胃給藥之后,我們對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,Y迷宮實(shí)驗(yàn)用來(lái)體現(xiàn)小鼠的認(rèn)知記憶能力。結(jié)果表明,安理申組、桑黃組、菌類(lèi)組分P組的AD小鼠的記憶和認(rèn)知水平都在一定程度上得到改善,而其中菌類(lèi)組分P對(duì)小鼠記憶和認(rèn)知的改善尤為顯著。最后,我們對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行心臟灌流固定、取腦、包埋切片等處理,進(jìn)行硫磺素S染色實(shí)驗(yàn)、剛果紅染色實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)檢測(cè)腦組織內(nèi)的淀粉樣蛋白斑塊的分布及數(shù)量,以及和AD發(fā)病相關(guān)的指標(biāo)蛋白BACE1、Adam10、PS1。我們發(fā)現(xiàn)菌類(lèi)組分P可以有效降低大腦內(nèi)Aβ老年斑的水平,同時(shí)減少了BACE1的數(shù)量,對(duì)Adam10、PS1蛋白的表達(dá)并無(wú)較大影響。提示桑黃組分和單體組分P通過(guò)抑制BACE1關(guān)聯(lián)的Aβ的生成環(huán)節(jié)和Aβ積聚的雙重環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。綜上所述,我們?cè)隗w外證明了桑黃及其單體組分P對(duì)Aβ42肽積聚的抑制作用和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,在體內(nèi)證明了桑黃組分和單體組分P通過(guò)抑制BACE1關(guān)聯(lián)的Aβ的生成環(huán)節(jié)和Aβ積聚的雙重環(huán)節(jié)發(fā)揮作用,為藥用真菌桑黃拮抗AD的新的生物活性功能提供了證據(jù)。
【圖文】：

圖 1.1 APP 的不同切割方式及 Aβ的生成途徑[42]量基于人組織、轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明，Aβ最終在胞外聚積的淀粉造成記憶損傷，其實(shí)在這些病理改變之前，Aβ的聚積在細(xì)胞內(nèi)就開(kāi)始了[42]。聚集階段，可溶性的 Aβ寡聚體被認(rèn)為具有更大的神經(jīng)毒性，會(huì)造成神經(jīng)突觸

6圖1.2 α分泌酶天然促進(jìn)劑第二類(lèi)是抑制β分泌酶活性的天然化合物。五種提取于白芷根的天然化合物(圖1.3（6-10）)，它們分別是異歐前胡素、歐前胡素、氧化前胡素、白當(dāng)歸腦、比克白芷素。這些化合物由于其低分子，可以很容易地穿過(guò)血腦屏障(BBB)，到達(dá)大腦。黃連提取物表小檗堿、格陵蘭黃連堿(圖1.3（11-12）)可以抑制β分泌酶的活性，格陵蘭黃連堿在減少Aβ的累積方面表現(xiàn)尤為明顯，但同時(shí)也可以抑制乙酰膽堿酯酶的生物活性及活性氧。四種白藜蘆醇低聚物(圖1.3（13-16）)來(lái)自于葡萄提取物，是葡萄酒的共同成分。它們可以抑制β分泌酶活性且呈劑量依賴(lài)性。菝葜根提取物(圖1.3（17-19）)也表現(xiàn)出潛在的抑制β分泌酶活性能力，其中圖1.3（17）為氧化白藜蘆醇。此外
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 葉偉;唐孝威;;老年性癡呆癥發(fā)病機(jī)制及其防治措施的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);2005年06期

2 王瑛,張海音;阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展(綜述)[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2002年01期

，

本文編號(hào)：2686501