【摘要】：第一章丹參新酮對(duì)血小板功能的影響目的:血栓性疾病嚴(yán)重威脅人類健康,需要更多供選擇的抗栓藥物治療。血小板的過度活化是血栓形成的一個(gè)重要因素,因而抗血小板藥物是其中重要一類。目前市售抗血小板藥物存在諸多不足,從傳統(tǒng)中藥尋找抗血小板活性成分是一個(gè)良好途徑。前期實(shí)驗(yàn)我們從丹參中發(fā)現(xiàn)一個(gè)抗血小板活性成分,但其作用特點(diǎn)及機(jī)制尚不清楚。本部分實(shí)驗(yàn)主要研究丹參新酮對(duì)血小板功能的影響及其可能的作用機(jī)制。方法:取健康成年雄性小鼠外周血,制備洗滌血小板和富血小板血漿(PRP)。用血小板聚集儀評(píng)價(jià)丹參新酮對(duì)不同激動(dòng)劑(膠原、CRP、凝血酶、ADP、花生四烯酸)引起的血小板聚集的影響;用血小板聚集儀評(píng)價(jià)丹參新酮對(duì)膠原、凝血酶引起的血小板釋放的影響;用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)丹參新酮對(duì)膠原、凝血酶誘導(dǎo)血小板p-selectin和JON/A的表達(dá);采用顯微熒光技術(shù)檢測(cè)丹參新酮對(duì)血小板在膠原表面的黏附和纖維蛋白原上擴(kuò)展功能的影響;觀察丹參新酮對(duì)血小板經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)的斑塊回縮功能的影響;用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)丹參新酮對(duì)不同激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板ROS的影響和血小板胞內(nèi)Ca2+的影響;采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)丹參新酮對(duì)血小板相關(guān)信號(hào)通路的影響。結(jié)果:終濃度為2μM,4μM,8μM的丹參新酮濃度依賴性地抑制膠原、CRP、凝血酶引起的血小板聚集,對(duì)ADP(4μM,10μM)和花生四烯酸(100μM,50μM)引起的血小板聚集無影響。丹參新酮能夠抑制膠原與凝血酶引起的血小板ATP釋放;抑制膠原誘導(dǎo)的血小板p-selectin和JON/A的表達(dá)。丹參新酮可抑制血小板在膠原表面的黏附和在固化纖維蛋白原表面的擴(kuò)展。丹參新酮能夠顯著抑制血小板斑塊回縮但不影響血小板胞內(nèi)鈣離子的釋放。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丹參新酮能夠抑制膠原受體下游的PLCγ2,PKC,Akt,GSK3β,ERK1/2等蛋白的磷酸化。丹參新酮能夠降低由整合素αIIbβ3介導(dǎo)的“outside-in”信號(hào)中的Src和FAK磷酸化水平,但是不抑制β3磷酸化。丹參新酮可抑制CRP誘導(dǎo)引起的血小板胞內(nèi)ROS水平增加,但對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+的內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流均無明顯影響。結(jié)論:丹參新酮可能通過影響血小板PLCγ2/PKC/ERK1/2,PI3K/Akt,Src/FAK信號(hào)抑制血小板“inside-out”和“outside-in”信號(hào)通路,從而抑制血小板活化和聚集,最終發(fā)揮抗血小板效應(yīng)。第二章丹參新酮對(duì)血栓形成的影響目的:上一章實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丹參新酮具有較好的體外抗血小板活性,且起效濃度較低。但是丹參新酮是否在經(jīng)機(jī)體代謝后仍具有抗血小板活性甚至抗栓活性尚不清楚。因此,我們?cè)隗w研究丹參新酮的抗血小板作用,同時(shí)觀察丹參新酮對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血栓形成的影響。方法:在體給藥檢測(cè)丹參新酮對(duì)膠原和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的影響。建立小鼠膠原合并腎上腺素制備小鼠肺栓塞模型,尾靜脈注射丹參新酮后,觀察其對(duì)模型小鼠肺血栓形成的影響;建立三氯化鐵誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型,觀察尾靜脈給予丹參新酮后,小鼠頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的變化;下腔靜脈狹窄法建立小鼠深靜脈血栓模型,觀察尾靜脈給予丹參新酮后,丹參新酮對(duì)小鼠下腔靜脈血栓形成率、血栓大小、血栓長(zhǎng)度的影響。觀察丹參新酮對(duì)小鼠斷尾出血時(shí)間的影響。結(jié)果:尾靜脈給予丹參新酮0.5 h后,膠原和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集相比對(duì)照組顯著減弱。丹參新酮改善肺栓塞小鼠的自發(fā)癥狀,減少膠原聯(lián)合腎上腺素引起的小鼠肺部微血栓的形成。丹參新酮能延長(zhǎng)小鼠頸動(dòng)脈血栓的形成時(shí)間,丹參新酮能夠降低深靜脈血栓發(fā)生率,并抑制深靜脈血栓模型小鼠血栓長(zhǎng)度。丹參新酮能夠輕微延長(zhǎng)小鼠斷尾出血時(shí)間。結(jié)論:丹參新酮可抑制小鼠血栓形成,輕度延長(zhǎng)出血時(shí)間。第三章血小板微顆粒(PMPs)對(duì)深靜脈血栓形成的影響目的:靜脈血栓的產(chǎn)生機(jī)制與動(dòng)脈血栓存在顯著差異,血小板在上述兩種血栓形成過程中可能發(fā)揮了不同作用,具有促凝作用的PMPs可能介導(dǎo)深靜脈血栓的發(fā)生,從而在靜脈血栓發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探討丹參新酮對(duì)深靜脈血栓形成的影響,我們以PMPs為切入點(diǎn),通過研究PMPs對(duì)深靜脈血栓形成的影響,研究血小板與深靜脈血栓形成的可能聯(lián)系。方法:用流式細(xì)胞術(shù)建立PMPs測(cè)定方法;比濁法研究PMPs對(duì)血小板聚集的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下腔靜脈狹窄小鼠外周血PMPs的相對(duì)含量;流式細(xì)胞術(shù)研究PMPs對(duì)小鼠外周血中性粒細(xì)胞活化的影響;免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究PMPs對(duì)小鼠深靜脈血栓中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的影響。結(jié)果:PMPs自身不引起血小板的聚集,但能夠促進(jìn)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集;PMPs能夠促進(jìn)下腔靜脈狹窄所致深靜脈血栓形成。DVT小鼠外周血中PMPs水平增加。經(jīng)PMPs干預(yù)的小鼠深靜脈血栓中NETs表達(dá)增加。結(jié)論:PMPs可能通過活化中性粒細(xì)胞,促其釋放NETs進(jìn)而促進(jìn)深靜脈血栓的形成。后續(xù)項(xiàng)目將研究丹參新酮對(duì)PMP產(chǎn)生及中性粒細(xì)胞NETs形成的影響。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 曹玉珠;劉兆國;單云龍;孫麗華;劉玉萍;韋忠紅;祝娉婷;吳紅雁;王愛云;陳文星;鄭仕中;陸茵;;血小板介導(dǎo)腫瘤血行轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2015年02期

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4 劉s，

本文編號(hào)：2685737