【摘要】：芪仙清鳴顆粒處方來(lái)源于上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方,已有6年使用歷史,由淫羊藿、黃芪、虎杖、巴戟天、枇杷葉、生地黃、川芎、旋覆花8味藥材組成,具有治療支氣管哮喘的功效。本文以芪仙清鳴顆粒為研究對(duì)象,采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)進(jìn)行化學(xué)成分表征及其在大鼠體內(nèi)的移行成分分析,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,初步闡明了芪仙清鳴顆粒的整合調(diào)節(jié)機(jī)制,建立了芪仙清鳴顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。1.芪仙清鳴顆粒全方化學(xué)成分辨識(shí)和表征首次建立芪仙清鳴顆粒的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析方法,基于分子量、碎片離子和保留時(shí)間,結(jié)合文獻(xiàn)和由對(duì)照品裂解途徑總結(jié)的裂解規(guī)律,在正負(fù)離子模式下,鑒定芪仙清鳴顆粒中的化學(xué)成分。最終鑒定出72個(gè)化合物,包括31個(gè)黃酮、15個(gè)萜類(lèi)、4個(gè)蒽醌類(lèi)、9個(gè)苯乙醇苷類(lèi)、4個(gè)二苯乙烯類(lèi)、1個(gè)決明松類(lèi)、1個(gè)生物堿、2個(gè)有機(jī)酸、1個(gè)糖類(lèi)和4個(gè)其他類(lèi)。以上化合物分別來(lái)源于處方中的淫羊藿(32個(gè))、黃芪(10個(gè))、虎杖(10個(gè))、巴戟天(1個(gè))、地黃(17個(gè))、枇杷葉(3個(gè))、旋覆花(3個(gè)),川芎中未檢出。2.芪仙清鳴顆�；瘜W(xué)成分定量分析首次建立芪仙清鳴顆粒的HPLC分析方法,依據(jù)對(duì)照品和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)色譜中確定的化合物的紫外吸收及保留時(shí)間,在芪仙清鳴顆粒的HPLC圖譜中共指認(rèn)出29個(gè)化合物,包括2個(gè)有機(jī)酸類(lèi)、7個(gè)苯乙醇苷類(lèi)、2個(gè)二苯乙烯類(lèi)、4個(gè)蒽醌類(lèi)、14個(gè)黃酮類(lèi)化合物。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定芪仙清鳴顆粒中糖和蛋白質(zhì)含量,分別為70~90%、2~4%。最終明確了芪仙清鳴顆粒中80%物質(zhì)組成。3.芪仙清鳴顆粒體內(nèi)移行成分及其作用機(jī)制分析采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS和UNIFI軟件分析芪仙清鳴顆粒在大鼠血清和尿液中的移行成分。在大鼠血清中鑒定出13個(gè)原形成分和30個(gè)代謝產(chǎn)物,大鼠尿液中鑒定出22個(gè)原形成分和21個(gè)代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物存在多對(duì)同分異構(gòu)體,表明體內(nèi)代謝位點(diǎn)存在多樣性。代謝反應(yīng)主要包括羥基化、去甲基化、甲基化、甲酸化、加氫、去葡萄糖反應(yīng)、葡萄糖醛酸化反應(yīng)、硫酸化反應(yīng)。通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合使用,并結(jié)合Cytoscape軟件的插件,對(duì)復(fù)方中入血成分和哮喘作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合,得到入血成分的靶點(diǎn)-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)(PPI)圖與哮喘作用靶點(diǎn)的PPI圖的交集,并通過(guò)設(shè)置參數(shù)篩選出核心靶點(diǎn)。對(duì)得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行代謝通路注釋,建立了“疾病-化合物-代謝通路”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果表明芪仙清鳴顆�？赡苁峭ㄟ^(guò)MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Cell adhesion molecules、Toll-like receptor信號(hào)通路、T cell receptor信號(hào)通路等14條代謝通路發(fā)揮抗哮喘作用。提示芪仙清鳴顆粒通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用,從而達(dá)到治療哮喘的目的。4.芪仙清鳴顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究基于前面的研究結(jié)果,選擇復(fù)方中既是活性成分又是特征性成分的淫羊藿苷和虎杖苷2個(gè)化合物進(jìn)行定量分析,建立HPLC法同時(shí)測(cè)定芪仙清鳴顆粒中淫羊藿苷和虎杖苷的含量。采用TLC法定性鑒別芪仙清鳴顆粒中的黃芪,黃芪甲苷斑點(diǎn)清新,陰性無(wú)干擾;HPLC法定性鑒別巴戟天,耐斯糖色譜峰分離度良好,陰性對(duì)照無(wú)干擾。以上方法準(zhǔn)確,穩(wěn)定可行,可用于芪仙清鳴顆粒的質(zhì)量控制。綜上所述,本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS對(duì)芪仙清鳴顆粒進(jìn)行了化學(xué)成分表征、在大鼠血液及尿液中的移行成分分析。通過(guò)HPLC法和紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定芪仙清鳴顆粒中各類(lèi)成分的含量,明確了芪仙清鳴顆粒中80%的物質(zhì)組成。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,分析了芪仙清鳴顆粒的體內(nèi)代謝通路,初步闡明其抗哮喘的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供給了科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上,建立芪仙清鳴顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
【圖文】：

B 正離子模式色譜圖圖 2-1 芪仙清鳴顆�；迳V圖Fig 2-1 Base peak chromatogram of Qixianqingming granule2.3.2.1 蒽醌類(lèi)化合物鑒定蒽醌類(lèi)化合物的裂解規(guī)律為：在負(fù)離子模式下逐級(jí)丟失 CO 或 CO2中性碎片，留存其共軛體系；側(cè)鏈取代基（羥基、甲基、羧基、羥甲基等）容易以 CO2、O、C2H2O、CH4等中性小分子（或原子）形式離去[33]。鑒定出的 4 個(gè)蒽醌類(lèi)化合物均來(lái)自虎杖。通過(guò)將保留時(shí)間、分子量、碎片離子與對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比，化合物 69 鑒定為大黃素�；衔� 33 和 43 均生成 m/z 431 的準(zhǔn)分子離子峰，在 MSE圖譜中，，峰 m/z 269為基峰，預(yù)示丟失一分子六碳糖（162Da）。觀察到的碎片 m/z241 及 m/z225 為大黃素的典型碎片，由于虎杖中蒽醌類(lèi)化合物六碳糖取代多為葡萄糖，因此推測(cè)化合物 33 和 43 為葡萄糖取代的大黃素的一對(duì)同分異構(gòu)體。兩個(gè)化合物的保留時(shí)間提

圖 2-2 化合物 33 的質(zhì)譜圖Fig 2-2 Mass spectrum of compound 33 38 的碎片離子 m/z 431、269、225 與大黃素-O-葡萄糖苷的離子峰 m/z 511 比峰 m/z 431 質(zhì)荷比多 80Da，我們推測(cè)化合物萄糖苷硫酸苷，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[35]。類(lèi)化合物鑒定鳴顆粒中共發(fā)現(xiàn) 15 個(gè)萜類(lèi)化合物，包括 1 個(gè)倍半萜苷類(lèi)化類(lèi)化合物，5 個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物及 1 個(gè)倍半萜內(nèi)酯。倍半萜苷類(lèi)化合物鑒定鳴顆粒中鑒定出 1 個(gè)倍半萜苷類(lèi)化合物且來(lái)自枇杷葉。倍半葉的主要活性成分，在正常組和四氧嘧啶引起的糖尿病模型小的作用[36]。枇杷葉中以橙花叔醇為苷元的倍半萜苷類(lèi)化合物
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R286

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本文編號(hào)：2685053