【摘要】：目的:特發(fā)性肺纖維化急性加重是特發(fā)性肺纖維化病情發(fā)展的特殊、危重階段,是該病死亡的最常見原因,具有病情進展迅速、發(fā)病率逐年升高、死亡率高等特點。目前國內(nèi)外關于該病的研究基礎相對薄弱,對該病的發(fā)病機制、治療方法尚無統(tǒng)一共識,臨床僅以緩解癥狀、糾正低氧血癥為目的的支持性護理以及糖皮質(zhì)激素作為主要治療手段,且療效仍存在巨大爭議;此外,在動物實驗基礎方面,尚無統(tǒng)一動物模型建立方法,一定程度上大大限制了實驗研究的深度和廣度。因此,本實驗研究以上述現(xiàn)狀為出發(fā)點,基于肺絡病指導理論,結合導師多年臨證經(jīng)驗,提出特發(fā)性肺纖維化急性加重期“肺熱絡瘀”的病機內(nèi)涵,并在肺絡構效理論指導下,擬“清熱解毒、養(yǎng)陰通絡”之中藥復方“清絡飲”,基于具有易行性、重現(xiàn)性、經(jīng)濟性的模型建立方法,驗證該復方治療效果并采用多方法、多靶點探討不同時相中藥復方干預Th1/Th2細胞因子失衡、MMPs/TIMPs失衡效果,從而全面揭示其抗肺纖維化急性加重的作用機理。本研究旨在為該病動物實驗研究發(fā)展奠定模型基礎、用科學的方法揭示中醫(yī)藥在該病治療方面的獨特優(yōu)勢、為未來新藥創(chuàng)制提供第一手研究資料。材料與方法:1、大鼠肺間質(zhì)纖維化急性加重模型建立1.1采用前后兩次氣管內(nèi)注射博來霉素的方法誘導特發(fā)性肺纖維化急性加重模型;1.2將120只SPF級雄性Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分成三組,每組40只,即AE-IPF組、IPF組以及Control組,適應性飼養(yǎng)3天后進行第一次博來霉素造模,于首次造模后第28天進行二次博來霉素造模。根據(jù)肺纖維化動態(tài)病理演變規(guī)律,設定7d、14d、31d、35d、42d五個時間點進行取材和指標觀察;1.3觀察不同時相各組大鼠一般生存狀態(tài)、干濕重比、肺系數(shù)、肺組織形態(tài)學指標(肉眼外觀、HE染色及肺泡炎病理評分、Masson染色及纖維化病理評分);1.4觀察31d、35d、42d各組大鼠動脈血氧分壓;1.5檢測不同時相各組大鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量;1.6采用免疫組化方法檢測不同時相各組大鼠肺組織內(nèi)α-SMA蛋白表達水平2、探討中藥復方清絡飲對博來霉素誘導大鼠IPF各分期的作用及機制2.1采用前后兩次氣管內(nèi)注射博來霉素的方法復制特發(fā)性肺纖維化急性加重模型;2.2將240只SPF級雄性Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分成六組,每組40只,即Control組、AE-IPF組、Low-dose組、Middle-dose組、High-dose組、GCS(激素)組。設定7d、14d、28d、31d四個時間點進行取材和指標觀察;2.3觀察各組大鼠各時相一般生存狀態(tài)、干濕重比、肺系數(shù)、肺組織形態(tài)學指標(肉眼外觀、HE染色及肺泡炎病理評分、Masson染色及纖維化病理評分);2.4觀察28d、31d各組大鼠動脈血氧分壓、計算各組血氧分壓在31d時平均下降率;2.5檢測各組大鼠各時相肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量;2.6采用western-blot、免疫組化、Quantitative Real-time PCR方法檢測各組大鼠各時相對肺組織α-SMA表達的情況;2.7多種方法觀察各時相各組大鼠Th1/Th2細胞因子失衡狀態(tài):采用ELISA、western-blot、免疫組化、Quantitative Real-time PCR方法,分別從含量、蛋白表達、m RNA表達三個層次檢測各時相各組大鼠IL-12、IL-4、IFN-γ水平,并探討IL-12與IL-4/IFN-γ比值相關性,證實IL-12具有調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ的比值,調(diào)整細胞因子失衡狀態(tài)的作用,闡明清絡飲干預Th1/Th2細胞因子失衡的作用機制;2.8多種方法觀察各時相各組大鼠MMP-9/TIMP-1失衡狀態(tài):采用western-blot、免疫組化、Quantitative Real-time PCR方法,分別從多層次檢測各時相各組大鼠MMP-9、TIMP-1蛋白和m RNA表達情況,闡明清絡飲干預MMP-9/TIMP-1失衡、加速ECM降解的作用機制。結果:1、大鼠肺間質(zhì)纖維化急性加重模型建立1.1一般狀態(tài):二次造模前,IPF組與AE-IPF組大鼠一般狀態(tài)無差異,較同期Control組更差;二次造模后,與IPF組相比AE-IPF組大鼠出現(xiàn)明顯喘息氣促、呼吸困難、抓鼻紫紺狀態(tài),且體重呈持續(xù)下降趨勢、死亡率顯著增加;1.2肺濕干重量比、肺系數(shù):二次造模后AE-IPF組W/D、肺系數(shù)與IPF、Control組相比出現(xiàn)顯著增高,即出現(xiàn)明顯的急性肺水腫表現(xiàn);1.3肺組織形態(tài)學:AE-IPF組大鼠7d時肺組織呈現(xiàn)肺泡炎改變?yōu)橹鳌?4d以成纖維細胞增生為主、31d以后表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、大量炎性浸潤、肺透明膜形成、大量膠原纖維沉著、成纖維細胞灶活躍,與Control組和IPF組相比分別在一次造模和二次造模后出現(xiàn)顯著差異;1.4動脈血氧分壓:與其他兩組比較,AE-IPF組31d時Pa O2出現(xiàn)最低水平,隨后在35d、42d出現(xiàn)增高趨勢,42d時AE-IPF組動脈血氧分壓與IPF組相比無顯著差異;1.5組織內(nèi)羥脯氨酸含量:AE-IPF組大鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量在實驗過程中持續(xù)增加,二次造模后三個時間點含量均顯著高于同期IPF組;1.6α-SMA免疫組化:實驗全程Control組大鼠肺組織α-SMA僅在較大血管、支氣管壁的平滑肌細胞胞漿中呈現(xiàn)弱陽性表達;IPF組自7d開始α-SMA表達水平持續(xù)緩慢增高;AE-IPF組二次造模前與同期IPF組陽性表達強度無顯著差異,但在二次造模后仍持續(xù)出現(xiàn)陽性表達增強,陽性表達強度顯著高于同期IPF組。2、探討中藥復方清絡飲對肺間質(zhì)纖維化急性加重大鼠的作用及機制2.1成功復制肺間質(zhì)纖維化急性加重模型;2.2一般狀態(tài)、肺濕干重量比、肺系數(shù):中藥復方清絡飲能夠明顯改善各時間點大鼠一般狀態(tài)和體重下降趨勢、降低死亡率、減輕急性肺水腫,從整體上對一般功能狀態(tài)損傷有一定改善作用,其中中劑量組效果最佳,部分指標改善方面優(yōu)于西藥組;2.3肺組織形態(tài)學:中藥復方清絡飲能夠在病理組織形態(tài)學方面能夠有效減輕肺間質(zhì)纖維化急性加重期急性彌漫性肺泡炎程度、改善中晚期及急性加重期肺內(nèi)細胞外基質(zhì)沉積、抑制活躍的成纖維細胞灶形成,其中中劑量組效果最佳,在改善纖維化程度方面略優(yōu)于西藥組;2.4動脈血氧分壓:中藥復方清絡飲能夠明顯減輕大鼠機體低動脈血氧分壓狀態(tài),改善急性加重期大鼠缺氧狀態(tài),31d各實驗組中中劑量組動脈血氧分壓與28d相比下降率最低,效果最佳。2.5組織內(nèi)羥脯氨酸含量:中藥復方清絡飲能夠有效降低肺纖維化各個階段(尤其是急性加重期)組織內(nèi)羥脯氨酸含量,減少膠原蛋白合成,減輕細胞外基質(zhì)沉積,各實驗劑量比較中劑量組效果最佳。2.6α-SMA蛋白和mRNA表達:中藥復方清絡飲能夠減少肺組織α-SMA蛋白表達水平和m RNA表達水平、抑制Fb向MFb轉化、阻斷成纖維細胞灶生成過程、延緩IPF病理過程,中劑量組效果最佳。2.7 Th1/Th2細胞因子:與空白組相比,模型組出現(xiàn)了顯著Th2優(yōu)勢現(xiàn)象,即IL-4表達水平增高、IL-12和IFN-γ表達水平降低。中藥復方清絡飲能夠減少大鼠血清中IL-4含量,增加IFN-γ和IL-12含量;下調(diào)肺組織中IL-4蛋白和IL-4m RNA表達水平,上調(diào)IFN-γ和IL-12蛋白和m RNA表達水平,糾正Th2漂移狀態(tài),恢復Th1/Th2細胞因子平衡,延緩肺纖維化病理進程,中劑量組效果最佳且略優(yōu)于西藥組。2.8 MMP-9/TIMP-1:與空白組相比,模型組大鼠肺組織中MMP-9m RNA/TIMP-1m RNA數(shù)值隨肺纖維化病程進展呈現(xiàn)“早期增大-中晚期減小-急性加重期增大”的表現(xiàn),且MMP-9、TIMP-1蛋白和m RNA表達水平在各個時間點均有不同程度上調(diào),其中TIMP-1表達呈持續(xù)增高狀態(tài),而MMP-9表達水平在7d時顯著增高、14d-28d出現(xiàn)短暫下降、28d再次增高。中藥復方清絡飲能夠下調(diào)各個時間點肺組織中MMP-9和TIMP-1蛋白和m RNA表達水平,使MMP-9m RNA/TIMP-1m RNA持續(xù)趨向平衡,進而減輕肺泡基底膜損傷、促進膠原降解、抗肺纖維化,各中藥劑量中中劑量組效果最佳,且在下調(diào)急性加重期TIMP-1蛋白表達水平方面明顯優(yōu)于西藥組。結論:1、采用博來霉素先后兩次(0d,5mg/kg;28d,7mg/kg)氣管內(nèi)注射方法可成功誘導大鼠肺間質(zhì)纖維化急性加重模型;各觀察時間點相比較,31d時模型大鼠臨床表現(xiàn)、病理變化與人類特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化急性加重表現(xiàn)最為接近,可以將其作為急性發(fā)作模型觀察的關鍵時間點。2、中藥復方清絡飲能夠有效改善AE-IPF大鼠喘息、咳嗽、體重下降等一般狀態(tài),改善缺氧狀態(tài),減輕肺泡炎癥、減少膠原合成和細胞外基質(zhì)沉積,從而改善大鼠AE-IPF程度。3、中藥復方清絡飲可抑制Th2代表性細胞因子----IL-4表達,促進Th1代表性細胞因子---IFN-γ表達,促進Th1/Th2關鍵維穩(wěn)細胞因子---IL-12表達,改善Th1/Th2細胞因子失衡狀態(tài),延緩肺纖維化進展,減輕急性加重病理狀態(tài)。4、IL-12在維持Th1/Th2細胞因子平衡方面存在重要作用。5、中藥復方清絡飲可通過抑制MMP-9、TIMP-1表達,促進MMP-9/TIMP-1動態(tài)平衡,延緩肺纖維化進展,減輕急性加重病理狀態(tài)。6、理論研究認為絡病理論指導下AE-IPF基本病機為“肺熱絡瘀”,其中“肺熱”主要包括痰熱、毒熱、陰虛肺熱;“絡瘀”主要包括氣閉絡瘀、氣虛絡瘀、痰凝血瘀、毒損絡瘀、瘀熱互結。
【圖文】：

基于肺熱絡瘀病機理論中藥復方干預 AE-IPF 的作用機制研究ose 0.494±0.108*▲▲0.618±0.160**▲▲0.776±0.140**▲▲0.887±0.23 0.463±0.112*▲▲0.560±0.612**▲▲0.698±0.148**▲▲0.817±0.17注:與 Control 組比較:*P＜0.05，，**P＜0.01；與 AE-IPF 組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與 GCS 組比較:#P＜0.05，##P＜0.01圖 28 各組大鼠不同時間點 IL-4/IFN-γ比值變化折線圖

8IL-12免疫組化蛋白表達位置示意圖（×100倍）
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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