【摘要】：目的:本文利用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠IBD模型,給予黃連素處理,分離小鼠腸黏膜上皮細胞檢測其在調(diào)節(jié)Th2和Th17功能中可發(fā)揮重要作用的細胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25和IL-33,同時檢測小鼠腸固有層淋巴細胞幾種代表性的細胞因子IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ,以了解黃連素誘導(dǎo)腸黏膜上皮細胞分泌的細胞因子對免疫細胞可能的調(diào)節(jié)作用,以進一步探究黃連素通過影響腸黏膜上皮細胞細胞因子分泌的種類和水平,間接調(diào)節(jié)腸道免疫細胞免疫功能,減輕腸道炎癥的新機制。研究方法:1、模型建立及實驗分組:利用C57BL/6小鼠,建立DSS誘導(dǎo)的急性腸炎動物模型:五天內(nèi)實驗組(黃連素+DSS組)與對照組(DSS組)小鼠均自由飲用3%DSS(用PBS配置)溶液,空白對照組(PBS組)小鼠自由飲用PBS溶液。實驗組小鼠每天早八點灌胃黃連素溶液,對照組與空白對照組灌胃等量的PBS溶液,三組小鼠于第六天處死。2、按照Cooper HS的方法,每天定時測量小鼠體重,觀察糞便性狀、及大便隱血狀況。3、組織學結(jié)果鑒定:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,三組小鼠處死后各取近心端1/2處結(jié)腸組織0.5cm,浸泡于4%多聚甲醛溶液固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后在光學顯微鏡下觀察模型組織形態(tài)結(jié)構(gòu)以及炎癥情況,并按照炎癥分級標準評估病理組織學得分。4、腸黏膜上皮細胞的鑒定與細胞因子的檢測:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,處死小鼠,三組取腸管后均分離并提取腸黏膜上皮細胞(IEC);用流式細胞儀鑒定IEC并細胞計數(shù)后;用Real-time PCR法、Western blotting法檢測腸黏膜上皮細胞細胞因子IL-6、IL-18、IL-23、IL-25、IL-33的表達水平。5、腸固有層淋巴細胞的鑒定與細胞因子的檢測:急性腸炎模型誘導(dǎo)第六天,處死小鼠,三組取腸管后均分離并提取腸固有層淋巴細胞(LPL);用流式細胞儀鑒定LPL并細胞計數(shù)后,在體外刺激48h,用ELISA法檢測其IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ的表達水平。研究結(jié)果:1、DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型建立成功。與PBS組小鼠相比,疾病模型小鼠均出現(xiàn)IBD癥狀,存在活動減少、體型消瘦、精神萎靡、排泄稀便、血便的現(xiàn)象,疾病活動指數(shù)上升,腸管明顯縮短、狹窄變形、腸腔內(nèi)存在稀便。但黃連素+DSS組小鼠較DSS組小鼠相比,疾病癥狀較輕,腸管病變情況較輕,結(jié)果說明經(jīng)口投黃連素使小鼠急性腸炎癥狀減輕。2、HE染色結(jié)果顯示,疾病模型小鼠與PBS組小鼠相比均存在杯狀細胞消失、大量炎性細胞浸潤的情況。DSS組比黃連素+DSS組情況更加嚴重,杯狀細胞大面積消失、隱窩大面積消失,炎性細胞浸潤至黏膜肌層,黏膜增厚并伴有水腫(P0.01)。結(jié)果說明經(jīng)口投黃連素使小鼠腸道炎癥程度減輕。3、流式細胞術(shù)表面染色實驗中,檢測到經(jīng)純化的腸黏膜上皮細胞層細胞CD3~-B220~-細胞可達95%以上,CD45.2呈單峰,而未經(jīng)純化的腸黏膜上皮層細胞CD3~-B220~-僅占43.5%,CD45.2呈雙峰。結(jié)果說明純化腸黏膜上皮細胞方法有效。4、流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色實驗中,分離的腸黏膜上皮細胞經(jīng)流式胞內(nèi)染色FITC-CK18,發(fā)現(xiàn)峰值明顯右移,陽性率達85%以上。結(jié)果可證明所提細胞為腸黏膜上皮細胞。5、Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示,與DSS組小鼠相比,黃連素+DSS組小鼠腸黏膜上皮細胞內(nèi)IL-6、IL-23 mRNA表達水平明顯下降(P0.01),IL-25、IL-33 mRNA表達水平明顯下降(P0.05),IL-18mRNA表達水平明顯上升(P0.05)。以上結(jié)果說明,在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎中,黃連素可以下調(diào)腸黏膜上皮細胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33 mRNA的表達水平,提升IL-18mRNA的表達水平。6、應(yīng)用Western blotting法檢測結(jié)果顯示,與DSS組相比,黃連素+DSS組小鼠腸黏膜上皮細胞內(nèi)IL-6、IL-23和IL-25蛋白表達水平明顯降低(P0.05),IL-33蛋白表達水平明顯降低(P0.01),IL-18蛋白表達水平明顯上升(P0.05),與mRNA檢測結(jié)果相符。進一步證實黃連素可下調(diào)腸黏膜上皮細胞細胞因子IL-6、IL-23、IL-25和IL-33表達水平,提升IL-18表達水平。7、流式細胞術(shù)表面染色實驗中,檢測到所提腸固有層淋巴細胞樣本中可圈出大量淋巴細胞(64.1%),其中CD3~+T細胞占46.1%,進一步分群可見51.4%為CD3~+CD4~+T細胞,29.0%為CD3~+CD8~+T細胞,其分群合理。可證實所提細胞為腸固有層淋巴細胞。8、ELISA法檢測結(jié)果顯示,與DSS組小鼠相比,黃連素+DSS組小鼠腸固有層淋巴細胞IL-4表達水平明顯下降(P0.01)、IL-17A表達水平明顯下降(P0.05),而IFN-γ表達水平明顯上升(P0.001)、IL-10表達水平明顯上升(P0.05)。結(jié)果說明,在DSS誘導(dǎo)的急性腸炎中,應(yīng)用黃連素使LPL減少了Th2型和Th17細胞分泌的細胞因子,增強了Th1型和Treg細胞分泌的細胞因子,與腸黏膜上皮細胞的此類細胞因子變化水平相類似。結(jié)論:1、在炎癥狀態(tài)下,黃連素可抑制腸黏膜上皮細胞細胞因子IL-6、IL-23、IL-25、IL-33的表達水平,提升IL-18的表達水平。2、黃連素可通過影響腸黏膜上皮細胞分泌細胞因子種類和水平,參與腸固有層淋巴細胞應(yīng)答,發(fā)揮免疫調(diào)理作用,減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠腸黏膜炎癥。
【圖文】：

3 結(jié)果黃連素使小鼠腸道炎癥程度減輕降率與疾病活動指數(shù)的結(jié)果造模開始，每天稱量三組小鼠的體重、并觀察其大便形狀、便血等S 組小鼠相比，另兩組小鼠均出現(xiàn) IBD 癥狀。如圖 1.1 所示，從第SS 組小鼠體重明顯下降，并隨著天數(shù)增加體重持續(xù)下降。而黃連鼠第三天開始體重才略微下降，，并且體重下降幅度一直低于DSS組天開始黃連素+DSS 組與 DSS 組形成明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.05）黃連素+DSS組小鼠相比，存在活動減少、體型消瘦、精神萎靡的泄稀便、血便情況比黃連素+DSS 組小鼠更為嚴重。疾病活動指數(shù)，黃連素+DSS組與 DSS組形成明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.01）。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文為進一步分析小鼠腸管病變，我們解剖三組小鼠取出完整大腸，如圖 1.2所示，疾病模型小鼠較 PBS 組小鼠腸管相比，存在腸管明顯縮短、狹窄變形、腸腔內(nèi)稀便的情況，但黃連素+DSS 組腸管與 DSS 組腸管相比病變狀況較輕，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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