【摘要】：研究背景近年來,由于肺癌死亡率的逐漸升高,預(yù)計(jì)我國將于2025年成為肺癌大國。因此肺癌預(yù)防和治療刻不容緩!雖然治療肺癌的方法有很多,但現(xiàn)在大多數(shù)患者仍需接受傳統(tǒng)的治療手段:化療。但化療的副作用大,療效不斷下降,臨床化療效果越來越不盡如人意,故亟需尋找新藥物以增強(qiáng)肺癌化療效果,降低化療副作用。崗田酸是一類細(xì)胞滲透性聚醚類復(fù)合物,蛋白磷酸酶PP1、PP2A的抑制劑,低濃度下可誘導(dǎo)正常細(xì)胞癌變,極低濃度下可作為治療癌癥的藥物,且在肺癌方面的治療鮮見報(bào)道。姜黃素被人們認(rèn)為是第三代抗腫瘤藥物,1996年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于肺癌、結(jié)腸癌等的治療,其與崗田酸聯(lián)合應(yīng)用于肺癌的研究未見報(bào)道。本文以聚醚類物質(zhì)崗田酸、二酮類化合物姜黃素為研究藥物,探究這兩種藥物對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響,并解析崗田酸與姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為研發(fā)治療肺癌的新藥物提供理論依據(jù)。研究方法1.MTT比色法檢測(cè)與分析崗田酸、姜黃素及其兩者的聯(lián)合對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響;金正均公式分析兩藥的互作關(guān)系;臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549活細(xì)胞數(shù)量,進(jìn)一步檢測(cè)藥物作用效果。2.Giemsa染色法、Hoechst33258染色法、倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察藥物對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。3.熒光分光光度計(jì)檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量、JC-1標(biāo)記的線粒體的去極化;熒光倒置顯微鏡下觀察Rhodamine123標(biāo)記的線粒體膜電位變化;Western Blot和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)崗田酸、姜黃素作用下線粒體途徑中的蛋白Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C、A549細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA的響應(yīng)。研究結(jié)果1.一定劑量范圍內(nèi),崗田酸和姜黃素及其二者聯(lián)合均可抑制A549細(xì)胞的增殖,表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性,且雙藥聯(lián)合的抑制效果要好于單藥的作用。金氏公式計(jì)算結(jié)果證實(shí)了兩藥聯(lián)合作用于A549細(xì)胞具有相加或協(xié)同作用。2.藥物處理48 h后,A549細(xì)胞形態(tài)變圓,體積縮小,細(xì)胞相互分離,胞內(nèi)染色質(zhì)凝集,空泡化嚴(yán)重,膜外圍出現(xiàn)凋亡小體,部分細(xì)胞破碎解體,表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。與單藥處理組相比,崗田酸與姜黃素聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更嚴(yán)重。3.20 ng/m L崗田酸、20μg/m L姜黃素、20 ng/m L崗田酸+20μg/m L姜黃素處理48 h后,A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量極顯著性上升,線粒體去極化嚴(yán)重;Rhodamine123檢測(cè)線粒體膜電位也發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞內(nèi)膜電位的下降,說明崗田酸與姜黃素可能是通過ROS、線粒體參與的胞內(nèi)信號(hào)通路引發(fā)A549細(xì)胞凋亡。Western Blot結(jié)果顯示:胞內(nèi)蛋白Bax、細(xì)胞色素C的表達(dá)明顯增多,Bcl-2表達(dá)下調(diào),說明藥物作用下細(xì)胞發(fā)生凋亡,兩藥聯(lián)合作用比單藥作用強(qiáng),崗田酸和姜黃素都由線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其凋亡。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:DNA條帶大小不一,出現(xiàn)梯狀條帶,說明藥物作用下A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,核內(nèi)染色質(zhì)降解。聯(lián)合處理組DNA條帶最長、最亮,說明藥物聯(lián)合作用下細(xì)胞凋亡的程度比單藥作用更強(qiáng)。結(jié)論上述結(jié)果表明,崗田酸、姜黃素聯(lián)合可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增值,通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其凋亡。
【圖文】：

第四部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第四部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 崗田酸、姜黃素及聯(lián)合對(duì) A549 細(xì)胞增殖的影響.1 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)崗田酸對(duì) A549 細(xì)胞增殖抑制率如圖 1 所示，濃度在 0-60 ng/ml 范圍內(nèi)，崗田酸對(duì) A549 細(xì)胞的增殖抑制作用不斷增72h 時(shí)，隨著崗田酸劑量的不斷加大，抑制率不斷的升高，，且與 24、48h 時(shí)相比，抑最高，說明有崗田酸不僅有劑量依賴性也具有時(shí)間依賴性。

圖 2 姜黃素作用于 A549 細(xì)胞的抑制率Fig2. The effect of Curcumin onA549 cells multiplication within 72h.同一時(shí)間與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，同一濃度與 24h 處理組比較 P<0.05，P<0.01。.1.3 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)崗田酸聯(lián)合姜黃素對(duì) A549 細(xì)胞的增殖抑制率如圖 3，4，5 所示，20 μg/mL 姜黃素與三個(gè)崗田酸濃度（20 ng/mL,40 ng/mL,60 ng/m2h 內(nèi)聯(lián)合孵育 A549 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，A549 細(xì)胞存活率要低于崗田酸處理組和姜黃素處理組向看抑制率不斷升高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。三張折線圖對(duì)比發(fā)現(xiàn)，崗田酸濃度越高，抑也是隨之升高的。
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2683402