【摘要】：癌癥是世界范圍內(nèi)的一個主要公共衛(wèi)生問題,是二十一世紀世界上大多數(shù)國家的主要的死亡原因和提高預期壽命的最重要障礙,并且其發(fā)病率和死亡率在全世界迅速增長。盡管目前在癌癥的診斷和治療方面取得了重大進展,但癌細胞轉(zhuǎn)移仍然是患者獲得良好臨床效果的主要障礙,因為90%以上與癌癥有關的死亡是由腫瘤轉(zhuǎn)移所造成的。在癌癥中,腫瘤的發(fā)生,侵襲,轉(zhuǎn)移,以及腫瘤抵抗治療與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)有著密切的聯(lián)系。大量研究結果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)是EMT最有效的誘導劑之一,其可以通過Smad及非Smad通路促進癌細胞EMT的形成。異佛來心苷(Isoviolanthin)是名貴中藥鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)中的黃酮碳苷成分,其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用機制至今未見相關報道。本研究采用TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402的EMT作為癌細胞體外轉(zhuǎn)移模型,探討異佛來心苷對TGF-β1增強的肝癌細胞遷移,侵襲和EMT的影響,以及其相關的作用機制,本研究結果將為鐵皮石斛黃酮類成分的抗肝癌體外轉(zhuǎn)移活性提供研究基礎和依據(jù)。目的:基于TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信號通路,探討異佛來心苷對TGF-β1誘導兩種人肝癌細胞HepG2及Bel-7402的EMT的調(diào)控效應。方法1.MTT法檢測0-100 μM異佛來心苷對人正常肝細胞L02和人肝癌細胞HepG2及Bel-7402活性的影響,以確定合適的異佛來心苷濃度用于后續(xù)EMT實驗。2.克隆形成實驗檢測異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)對TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402克隆數(shù)量的影響。3.劃痕實驗檢測異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)對TGF-β1增強的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402遷移能力的影響。4.Transwell小室實驗檢測異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μìM)對TGF-β1增強的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402侵襲能力的影響。5.酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)檢測異佛來心苷(2.5μM,5 μM,10 μM)對TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)MMP-2 及 MMP-9 的影響。6.逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量 PCR(Reverse transcription-quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)實驗檢測異佛來心苷(2.5μM,5μM,10 μM)對TGF-βl誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮標記物E-cadherin和ZO-1,間質(zhì)標記物N-cadherin及vimentin,轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug的mRNA表達的影響。7.蛋白質(zhì)印跡實驗(Western boltting assay)檢測異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10μM)對TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮標記物蛋白E-cadherin和ZO-1,間質(zhì)標記物蛋白N-cadherin及vimentin,轉(zhuǎn)錄因子蛋白Snail及Slug,基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白MMP-2及MMP-9的影響,以及TGF-β1誘導的TGF-β/Smad和PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響。8.免疫熒光實驗(Immunofluorescence assay)觀察10 μM異佛來心苷對TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402中EMT上皮標記物蛋白E-cadherin,及間質(zhì)標記物蛋白vimentin的影響。9.劃痕和 Transwell 小室實驗檢測 20 μM TGF-β/Smad 抑制劑 SB4β1542,20 μM P13K/Akt抑制劑LY294002對TGF-β1誘導的人肝癌細胞HepG2及Bel-7402的遷移及侵襲能力的影響。Western boltting實驗檢測SB431542和LY294002對TGF-β!誘導的人肝癌細胞 HepG2 及 Bel-7402 中 E-cadherin,N-cadherin,Snail,及 MMP-2 的影響。結果1.MTT結果顯示100μM異佛來心苷濃度對人正常肝細胞LO2無明顯細胞毒性作用,低濃度(10μM)異佛來心苷對人肝癌細胞HepG2及Bel-7402無明顯細胞殺傷作用,但異佛來心苷呈劑量-時間依賴性抑制HepG2及Bel-7402細胞活性。2.克隆形成實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)劑量依賴性抑制TGF-β1增加的HepG2及Bel-7402細胞克隆數(shù)量。3.劃痕實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)劑量依賴性抑制TGF-β1增強的HepG2及Bel-7402細胞遷移能力。4.Transwell小室實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)劑量依賴性抑制TGF-β 1增強的HepG2及Bel-7402細胞侵襲能力。5.ELISA實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)劑量依賴性減弱TGF-β1增強的HepG2及Bel-7402細胞分泌MMP-2及MMP-9的能力。6.RT-qPCR實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5 μM,10 μM)劑量依賴性減弱 TGF-β1 增強的 HepG2 及 Bel-7402 細胞"N-cadherin,vimentin,Snail,Slug 的 mRNA基因表達水平,并增強TGF-β1減弱的E-cadherin和ZO-1的mRNA基因表達水平。7.Western boltting實驗結果表明異佛來心苷(2.5 μM,5μM,10μM)劑量依賴性減弱 TGF-β1 增強的 HepG2 及 Bel-7402 細胞 N-cadherin,vimentin,Snail,Slug,MMP-2及MMP-9蛋白表達水平,并增強TGF-β1減弱的E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平;異佛來心苷顯著降低TGF-β1誘導的HepG2及Bel-7402細胞TGF-β/Smad和 PI3K/Akt 信號通路相關蛋白 p-Smad2,p-Smad3,p-Akt,p-mTOR,和 p-P70S6K表達水平。8.免疫熒光實驗結果表明10μM異佛來心苷明顯增強TGF-β1減弱的HepG2及Bel-7402 細胞 E-cadherin 表達,減弱 TGF-β1 增強的 vimentin 表達。9.劃痕和Transwell小室實驗結果表明抑制劑SB431542和LY294002顯著降低TGF-β1增強的HepG2及Bel-7402細胞遷移和侵襲能力;Western boltting實驗結果表明SB431542和LY294002顯著增強TGF-β1減弱的E-cadherin蛋白表達水平,顯著降低TGF-β1增強的N-cadherin,Snail和MMP-2蛋白表達水平,抑制劑實驗結果與10 μM異佛來心苷實驗結果一致。結論本研究首次證明了異佛來心苷可以通過抑制TGF-β1誘導的TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制HepG2及Bel-7402細胞的遷移,侵襲和EMT。實驗結果表明了異佛來心苷可以作為鐵皮石斛發(fā)揮抗肝癌細胞轉(zhuǎn)移作用的活性成分之一。
【圖文】：

測異佛來心苷對人正常肝細胞Ｌ０２和肝癌細胞丨ｉ小時的生長抑制作用。折線圖均以平均值±標準差ｃｔｓ邋ｏｆ邋ｉｓｏｖｉｏｌａｎｔｈｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｎｏｒｅｌ－７４０２邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｏｒ邋２４邋ａｎｄ邋４８邋ｈ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｅ邋ｌｉｎｅ邋ｇｒａｐｈｓ邋（ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ）邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ．逡逑

和Ｂｅｌ－７４０２細胞在２４ｈ的遷移能力和４８小時的侵襲能力明顯高于正常組細胞，而逡逑異佛來心苷（２．５邋ｐＭ、５邋（＿ｉＭ和１０邋ｐＭ）明顯抑制了ＴＧＦ－ｐｉ誘導的ＨｅｐＧ２和逡逑Ｂｅｌ－７４０２細胞遷移和侵襲能力，，且呈劑量依賴性（圖３，邋ｐ＜０．０５）。這些結果表明，逡逑異佛來心苷能有效抑制ＴＧＦ－｜ｍ秀導的ＨｅｐＧ２和Ｂｅｌ－７４０２細胞的遷移和侵襲能力。逡逑２５逡逑
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2683189