【摘要】：麥芽是常見的一味消食藥,一直沿用“炒黃炒香”入藥的傳統(tǒng),與生麥芽比較,炒麥芽的“消食化滯”作用更強;目前,麥芽“炒香”工藝多以消化酶、黃酮類成分為評價指標(biāo)。而現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),麥芽炒香過程中,消化酶由于熱的影響,其活性必然下降;同時,黃酮類成分與“炒香”也缺乏必然聯(lián)系。麥芽中含有還原糖、氨基酸等傳統(tǒng)意義上的“無效成分”,炒制過程中可能發(fā)生Maillard反應(yīng),而產(chǎn)生具有“香味”的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物MRPs。因此,麥芽“炒香”工藝可能與還原糖、氨基酸、MRPs等傳統(tǒng)意義上的“無效成分”之間更具相關(guān)性。中醫(yī)理論認為,麥芽“炒香”后可達到“醒脾”的效果,即“炒香醒脾”�！捌⒅鬟\化”,在一定程度上,“炒香醒脾”可認為是香味物質(zhì)恢復(fù)脾臟運化升清功能,進而促進了營養(yǎng)成分、藥效成分的吸收。本項目通過考察麥芽“炒香”過程中,還原糖、氨基酸、丙烯酰胺、MRPs、5-HMF等傳統(tǒng)意義上的“無效成分”,以及麥黃酮、阿魏酸、兒茶素、槲皮素、山奈酚等“有效成分”的含量變化規(guī)律,采用HCA(Hierarchical cluster analysis,HCA)及PLS-DA(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)方法,評價麥芽“炒香”工藝,確定炒制終點;在此基礎(chǔ)上,采用離體、在體、整體動物模型,研究“炒香”對有效成分腸吸收的影響,進一步從MRPs促進阿魏酸、兒茶素、槲皮素、山奈酚等有效成分腸吸收的角度,探討“炒香醒脾”的作用機理。主要研究內(nèi)容如下:1麥芽“炒香”對成分的影響采用HPLC測定麥黃酮、槲皮素、山奈酚、兒茶素、阿魏酸、5-HMF及丙烯酰胺的含量;采用HPLC-ELSD測定D-葡萄糖、蔗糖、D-果糖及D-麥芽糖的含量;采用PITC柱前衍生-HPLC測定炒制過程中蘇氨酸(Thr),丙氨酸(Ala),甘氨酸(Gly),組氨酸(His),異亮氨酸(Ile),精氨酸(Arg),γ-氨基丁酸(γ-GABA),酪氨酸(Tyr),纈氨酸(Val),脯氨酸(Pro),蛋氨酸(Met),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),亮氨酸(Leu),賴氨酸(Lys)15種氨基酸的含量。研究炒制溫度、炒制時間對“有效成分”(麥黃酮、槲皮素、山奈酚、兒茶素、阿魏酸)、Maillard反應(yīng)物(糖類、氨基酸)及Maillard反應(yīng)產(chǎn)物(5-HMF、丙烯酰胺、A420)含量的影響,并采用HCA及PLS-DA,闡明炒制過程中各成分的動態(tài)變化規(guī)律,確定炒制終點。炒制溫度對有效成分的影響結(jié)果顯示,麥黃酮、槲皮素、山奈酚、兒茶素、阿魏酸等5種成分隨炒制溫度升高,含量變化不明顯。炒制溫度對Maillard反應(yīng)物糖、氨基酸的影響結(jié)果顯示,D-果糖、D-麥芽糖、D-葡萄糖等還原糖及氨基酸的量隨溫度增加整體表現(xiàn)為下降趨勢,而非還原糖蔗糖則表現(xiàn)為先升高后降低。炒制溫度對Maillard反產(chǎn)物5-HMF、丙烯酰胺、A420的影響結(jié)果顯示,當(dāng)炒制溫度在120℃以下時,均不產(chǎn)生5-HMF、丙烯酰胺,溫度大于140℃時,5-HMF、丙烯酰胺、A420緩慢增加,當(dāng)?shù)竭_一定溫度時,迅速增加至最大值后到達穩(wěn)態(tài)。以上結(jié)果表明,炒香對傳統(tǒng)意義上“有效成分”影響較小,而對Maillard反應(yīng)物及產(chǎn)物等“無效成分”影響較大。進一步采用聚類分析結(jié)果表明,麥芽炒制溫度可分為為生麥芽及90-140℃,160-180℃,200-220℃,240-260℃四類,PLS-DA分析表明,在炒制過程中蔗糖及Maillard反應(yīng)產(chǎn)物5-HMF、丙烯酰胺、A420的VIP(Variable importance,VIP)值較大,對區(qū)分麥芽不同炒制溫度樣品具有顯著的貢獻率,而“有效成分”及Maillard反應(yīng)物的貢獻率均較小。根據(jù)聚類結(jié)果及具有較大VIP貢獻率成分的藥理作用,并結(jié)合炒麥芽的顏色、香味,確定220℃為最佳炒制溫度。炒制時間對有效成分含量影響結(jié)果顯示,麥黃酮、槲皮素、山奈酚、兒茶素、阿魏酸等5種成分隨炒制時間延長,含量變化亦不明顯。炒制溫度對Maillard反應(yīng)物糖、氨基酸的影響結(jié)果顯示,隨炒制時間的延長,4種糖及氨基酸的量均呈降低趨勢,糖類含量在16 min后基本不再變化,氨基酸在8 min后含量基本保持不變。炒制溫度對Maillard反產(chǎn)物5-HMF、丙烯酰胺、A420的影響結(jié)果顯示,在0-18min之間,5-HMF及A420隨著炒制時間的增加,其含量不斷增加至最大值后基本保持不變,當(dāng)炒制時間在20 min后,開始產(chǎn)生丙烯酰胺且逐漸增加。以上結(jié)果進一步表明,炒香對傳統(tǒng)意義上“有效成分”影響較小,而對“無效成分”影響較大。聚類分析結(jié)果表明,13個不同炒制時間樣品可分為生麥芽,2-4min,6 min,8-14 min,16-26 min五類,根據(jù)5-HMF,丙烯酰胺及類黑素的藥理作用,選16-18 min為炒制最佳時間。2麥芽“炒香”對有效成分腸吸收的影響2.1離體模型采用離體外翻腸囊模型,應(yīng)用HPLC測定生麥芽(阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素+3種還原糖+15種氨基酸)及炒麥芽(阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素+MRPs)腸囊液中阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素的含量,考察“炒香”對4種成分腸吸收的影響。結(jié)果表明,4種成分在大鼠不同腸段均有吸收;與生麥芽比較,炒麥芽中槲皮素、山奈酚的Ka與Papp在十二指腸、空腸、回腸等三個腸段均明顯增加(p0.05);與生麥芽比較,炒麥芽中兒茶素的Ka與Papp在十二指腸與空腸亦顯著增加(p0.05);與生麥芽比較,炒麥芽組阿魏酸在回腸中Ka與Papp明顯增加(p0.05)。以上結(jié)果表明,“炒香”能在一定程度上促進有效成分在小腸中的吸收。2.2在體模型采用在體單向腸灌流模型,建立腸灌液中阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素的HPLC測定方法,考察“炒香”對麥芽中4種有效成分的影響。結(jié)果表明,與生麥芽比較,炒麥芽中兒茶素、山奈酚與槲皮素的Ka與Papp在十二指腸、空腸、回腸三個腸段均顯著增加(p0.05),阿魏酸在十二指腸與空腸的Ka與Papp顯著增加(p0.05)。結(jié)果進一步表明,麥芽“炒香”能促進有效成分的腸吸收;綜合比較Ka、Papp的大小,阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素在十二指腸中吸收較好。2.3整體動物模型采用整體動物模型,應(yīng)用HPLC-MS/MS測定血漿中阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素的含量,繪制濃度-時間曲線,比較Ka、AUC_(0-t)、C_(max)等藥動學(xué)參數(shù),考察“炒香”對麥芽中4種有效成分藥動學(xué)的影響。結(jié)果表明,與生麥芽比較,炒麥芽中兒茶素、阿魏酸、槲皮素及山奈酚的Ka、AUC_(0-t)及C_(max)均顯著增加(p0.05)。結(jié)果再次表明,“炒香”能促進麥芽有效成分的吸收。3麥芽中有效成分腸吸收機理研究3.1濃度及維拉帕米、EDTA、甘露醇對有效成分的腸吸收影響采用在體單向腸灌流模型,考察阿魏酸、兒茶素、山奈酚及槲皮素在小腸中的吸收機制。結(jié)果山奈酚、槲皮素的Ka、Papp隨濃度增加,未出現(xiàn)明顯變化,表明山奈酚、槲皮素的腸吸收機制為被動轉(zhuǎn)運。與中濃度比較,低濃度兒茶素、阿魏酸的Ka、Papp無顯著變化,但隨著濃度的進一步增加,兒茶素、阿魏酸的Ka、Papp顯著減少(p0.05),提示兒茶素、阿魏酸的吸收存在飽和現(xiàn)象,轉(zhuǎn)運過程中可能有載體的參與。加入維拉帕米及甘露醇后,阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素等4種成分的Ka與Papp無顯著變化,表明阿魏酸、兒茶素、山奈酚、槲皮素等4種成分不是P-gp蛋白及SGLT的底物;加入EDTA后,兒茶素、槲皮素、山奈酚的Ka與Papp顯著增加(p0.05),表明兒茶素、山奈酚、槲皮素等3種成分的吸收可能與緊密連接蛋白有關(guān)。3.2麥芽“炒香”對緊密連接蛋白表達的影響基于緊密連接蛋白介導(dǎo)兒茶素、山奈酚、槲皮素的腸吸收,進一步采用Western blot及q-PCR方法,考察“炒香”對十二指腸中緊密連接蛋白Claudin-1及ZO-1表達的影響。Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,生麥芽組的緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-1表達無明顯變化;與生麥芽比較,炒麥芽及MRPs中的ZO-1及Claudin-1蛋白表達明顯降低(p0.05)。q-PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,生麥芽組中緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-1 mRNA的表達無明顯變化;與生麥芽組比較,在炒麥芽及MRPs組中,ZO-1及Claudin-1 mRNA的表達均顯著降低(p0.05)。以上結(jié)果表明,麥芽“炒香”可“下調(diào)”緊密連接蛋白的表達,提高旁路吸收效率,促進腸吸收,且這種作用可能與MRPs有關(guān)。本項目研究結(jié)果表明,麥芽“炒香”對“無效成分”影響較大,而對“有效成分”影響較小,因此,以Maillard反應(yīng)產(chǎn)物5-HMF、丙烯酰胺及A420等傳統(tǒng)意義上“無效成分”作為“炒香”工藝的評價指標(biāo),確定炒制終點,為中藥炒制工藝研究提供新的視角。同時,麥芽“炒香”后形成的MRPs能促進“有效成分”的腸吸收,這可能是麥芽炒香“醒脾”的作用機制之一。本項目從Maillard的角度,研究麥芽“炒香”工藝,闡明“炒香醒脾”的作用機理,為中藥炮制工藝及傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研究提供新思路。
【圖文】：

注：A5-HMF B 兒茶素 C 阿魏酸圖 1 5-HMF、兒茶素、阿魏酸全波長掃描光譜圖he full-wavelength scanning spectrum of 5-HMF, Catechin, Fe件的建立il 100-5 C18(4.6 mmx250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為甲醇用梯度洗脫：0～20 min，2%～2%A，20～60 min，2%～法，檢測波長：0~13min，，283 nm，13~17 min，320 nm，160 min，320 nm；進樣量為 20 μL；流速 0.8 mL/min；柱溫及混合對照品的制備F、阿魏酸、兒茶素對照品，分別精密稱定 4.5 mg、18.8 mg定容至 25 mL，得濃度為 0.180 mg/mL、0.752 mg/mL、0.6阿魏酸、兒茶素對照品儲備液。量取上述對照品儲備液 5-HMF500 μL、兒茶素 500 μL、阿

13注：A 槲皮素 B 麥黃酮 C 山奈酚圖 2 槲皮素、麥黃酮、山奈酚全波長掃描光譜圖ull-wavelength scanning spectrum of Quercetin, Flavonoids, Ka件asil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為（B），采用梯度洗脫：0 ～ 60 min，20% ～ 35%A，6000%A；檢測波長為 345 nm；進樣量 20 μL；流速 0.8 mL/m和混合對照品的制備素、麥黃酮、山奈酚對照品，分別精密稱定 24 mg、3.7 mg，定容至 25 mL，得濃度為 0.960 mg/mL、0.148 mg/mL、0
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R283;R285.5

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本文編號：2683160