【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜炎、骨與軟骨破壞為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。病理過(guò)程主要是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成。在RA中,滑膜組織新生血管及血管翳的形成是其重要表現(xiàn),關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種促血管生成因子,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子、各種趨化因子及促炎性細(xì)胞因子等,這些促血管生成因子主要通過(guò)新生血管維持滑膜及關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥。CXCL12屬于趨化因子家族CXC類,具有多種生物學(xué)功能,對(duì)淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用,參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如艾滋病、癌癥、自身免疫性疾病等。在RA中,CXCL12及其受體CXCR4在關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均高表達(dá),參與RA的病理過(guò)程,如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在關(guān)節(jié)組織、滑膜細(xì)胞異常增生以及血管翳形成等。而血管翳形成是RA患者關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥形成的重要原因之一,CXCL12/CXCR4軸在RA患者關(guān)節(jié)中參與血管重塑和生成,研究發(fā)現(xiàn),在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中使用CXCL12阻滯劑AMD3100阻斷CXCL12/CXCR4軸后發(fā)現(xiàn),血管重塑障礙,新生的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)異常,毛細(xì)血管的生長(zhǎng)亦受到抑制等。CXCL12通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)通路調(diào)節(jié)ERK1/2的活化是血管內(nèi)皮、細(xì)胞增生的重要機(jī)制,在內(nèi)皮細(xì)胞中,G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein coup、led receptor kinase 2,GRK2)負(fù)性調(diào)節(jié)CXCR4受體,可以介導(dǎo)其內(nèi)吞與脫敏。芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是本課題組對(duì)芍藥苷(paeoniflorin,Pae)結(jié)構(gòu)進(jìn)行酯化修飾得到的新型活性單體。前期本課題組已研究CP-25較Pae生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、起效快等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)前期研究表明CP-25(25、50、100 mg·kg~(-1))對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠有確切的治療作用,可以顯著降低AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥,改善滑膜細(xì)胞異常增殖等,但其對(duì)AA關(guān)節(jié)的血管增生及血管翳影響機(jī)制尚不清楚。本課題在課題組既往的研究基礎(chǔ)上,通過(guò)建立大鼠AA模型,在體內(nèi)觀察AA模型中關(guān)節(jié)組織血管增生以及CXCL12/CXCR4表達(dá)情況,明確CXCL12/CXCR4與AA大鼠血管增生的關(guān)系以及CP-25的作用;體外以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)作為研究對(duì)象,觀察CXCL12/CXCR4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及CP-25的作用,為進(jìn)一步揭示CXCL12/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA異常的病理過(guò)程的機(jī)制,以及CP-25的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制提供依據(jù)。目的:1.建立AA大鼠模型,觀察CP-25的治療作用及CXCL12/CXCR4軸在AA大鼠滑膜組織、血清及脾臟組織中的變化,明確CXCL12/CXCR4軸在AA大鼠中的作用;2.觀察CXCL12/CXCR4軸在AA大鼠滑膜血管壁的變化,明確CXCL12/CXCR4與AA大鼠血管增生的關(guān)系;3.觀察CXCL12對(duì)HUVECs功能的影響以及CP-25的作用,研究GRK2、CXCR4以及ERK1/2表達(dá)情況,揭示GRK2通過(guò)調(diào)節(jié)CXCR4-ERK信號(hào)通路改善內(nèi)皮細(xì)胞功能以及CP-25的作用。方法:1.應(yīng)用完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)建立大鼠AA模型。造模成功后分為正常組、模型組、CP-25(50mg·kg~(-1))組及MTX(0.5 mg·kg~(-1))組,第17天采用灌胃方式給藥14次,第30天處死大鼠。記錄大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、體重、病理組織學(xué)、滑膜炎癥評(píng)分及血管翳評(píng)分;2.AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜及、脾臟的病理情況,用HE染色評(píng)價(jià)滑膜及脾臟的病理情況;免疫熒光評(píng)價(jià)滑膜血管增生;免疫組化法和ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜、脾臟及血清的CXCL12的表達(dá)水平;Western blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜及脾臟的CXCR4的表達(dá)水平;3.CCK-8法檢測(cè)CXCL12及CP-25對(duì)HUVEC增殖能力的影響;Transwell法、檢測(cè)CXCL12及CP-25對(duì)HUVEC遷移能力的影響;成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL12及CP-25對(duì)HUVEC形成血管能力的影響;4.Western blot方法檢測(cè)CXCL12及CP-25對(duì)HUVECs CXCR4、GRK2總蛋白、胞膜及胞質(zhì)以及ERK、p-ERK的表達(dá);免疫共沉淀法測(cè)GRK2與CXCR4、GRK2與p-ERK之間的共表達(dá)。結(jié)果:1.CP-25可改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)、脾臟和關(guān)節(jié)病理,抑制滑膜細(xì)胞異常增殖,抑制關(guān)節(jié)滑膜血管增生:CP-25(50 mg/kg)能明顯緩解AA大鼠關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),包括多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù);CP-25(50 mg·kg~(-1))可改善AA大鼠的脾臟病理改變,包括降低動(dòng)脈周圍淋巴細(xì)胞的數(shù)量,同時(shí)關(guān)節(jié)的病理學(xué)檢測(cè)提示CP-25(50 mg·kg~(-1))能明顯減少滑膜組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),降低滑膜組織炎性浸潤(rùn)評(píng)分和血管翳評(píng)分。2.AA大鼠滑膜、脾臟中CXCL12/CXCR4的表達(dá)及血清中CXCL12表達(dá)的變化及CP-25的作用:AA大鼠滑膜、脾臟中CXCL12/CXCR4的表達(dá)較正常組均明顯升高,CP-25對(duì)其具有下調(diào)作用,且滑膜組織中CXCL12/CXCR4的表達(dá)與滑膜組織血管翳評(píng)分成正相關(guān)關(guān)系。3.CXCL12對(duì)HUVEC增殖、遷移、成管能力的影響及CP-25的作用:CXCL12(50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明顯增加HUVEC增殖,CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))能明顯降低CXCL12(50 ng·m L~(-1))刺激HUVEC的異常增殖;CXCL12(12.5,25,50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明顯增加HUVEC的遷移能力,且在24 h達(dá)到峰值,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol·L~(-1))均能明顯下調(diào)CXCL12(50 ng·m L~(-1))所引起HUVEC的遷移增加;CXCL12(12.5,25,50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明顯增加HUVEC的成管能力,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol·L~(-1))均能明顯抑制調(diào)CXCL12(50 ng·m L~(-1))所引起HUVEC的成管能力增加。4.CXCL12對(duì)HUVEC的CXCR4、GRK2、ERK和p-ERK表達(dá)的影響及CP-25的作用:CXCL12(100 ng·m L~(-1))刺激HUVEC后其GRK2總表達(dá)升高、胞質(zhì)表達(dá)減少而胞膜表達(dá)升高,CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))可調(diào)節(jié)其異常表達(dá);刺激后CXCR4總表達(dá)不變,但胞質(zhì)表達(dá)升高而胞膜表達(dá)減少,而CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))可調(diào)節(jié)其回歸正常;CXCL12(100 ng·m L~(-1))及CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)mol·L~(-1))對(duì)HUVEC的ERK表達(dá)均無(wú)明顯影響,但CXCL(100 ng·m L~(-1))刺激后p-ERK表達(dá)增加,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)mol·L~(-1))則可下調(diào)其異常升高;CXCL12(100 ng·m L~(-1))刺激HUVEC后,上調(diào)GRK2與CXCR4的共表達(dá),下調(diào)GRK2與p-ERK的共表達(dá),CP-25(10~(-6) mol·L~(-1))則可對(duì)抗CXCL12的作用。結(jié)論:1.CP-25對(duì)大鼠AA具有治療作用,可以降低AA大鼠全身表現(xiàn)評(píng)分、降低AA大鼠的足爪腫脹度;2.CXCL12及其受體CXCR4的高表達(dá)與AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性病變及血管增生有關(guān);3.CP-25可抑制CXCL12誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移、成管能力;4.CP-25對(duì)大鼠AA的治療作用與抑制其關(guān)節(jié)滑膜血管增生相關(guān),其作用機(jī)制可能與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞GRK2的膜表達(dá),增加其胞質(zhì)表達(dá),恢復(fù)胞質(zhì)GRK2對(duì)ERK活化的抑制有關(guān)。
【圖文】：

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4（glucose transporter 4，GLUT4），，增加核轉(zhuǎn)錄actor-κB，NF-κB）的轉(zhuǎn)錄活性，在糖尿病患者中產(chǎn)生胰島素抵RK2 表達(dá)異常以及功能的紊亂，在 RA 中主要表現(xiàn)為炎性因子軟骨及骨破壞等[29]。在既往的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)建立大鼠 AA 模型，觀察 CXCL12的滑膜、脾臟中的變化以及 CP-25 對(duì)其影響，重點(diǎn)以關(guān)節(jié)滑膜皮細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察AA模型血管增生情況、關(guān)節(jié)滑膜中 的表達(dá)情況及其與血管增生相關(guān)性，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中觀察 生物學(xué)功能影響及 CP-25 的作用，通過(guò)檢測(cè) CXCL12/CXCR4況、GRK2 和 CXCR4 表達(dá)情況及變化趨勢(shì)以及 GRK2 與 C情況，進(jìn)一步揭示 CXCL12/CXCR4 信號(hào)在 AA 大鼠滑膜血管能機(jī)制，以及 CXCL12/CXCR4 信號(hào)在內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中，為揭示 CP-25 的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的新機(jī)制提供理論依

CP-25對(duì)AA大鼠體重的影響（x±s，n=10）
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2683132