發(fā)布時(shí)間：2020-05-27 04:17

【摘要】：背景抑郁癥是一類(lèi)常見(jiàn)的精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有長(zhǎng)時(shí)間情緒低落、思維滯緩、運(yùn)動(dòng)抑制的“三大特征”以及高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高自殺率的“三高特點(diǎn)”。近年來(lái),伴隨經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和各種壓力源的增加,抑郁癥的發(fā)病率急劇攀升。大量的抗抑郁藥物相繼涌現(xiàn)并應(yīng)用于臨床,這些藥物能夠在一定程度上緩解病人的抑郁樣癥狀,但是并不能徹底治愈抑郁癥,并且這些藥物價(jià)格昂貴、起效緩慢、復(fù)發(fā)率高、還會(huì)引起一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥。這些因素嚴(yán)重限制了抗抑郁藥物的治療效果,因此開(kāi)發(fā)更為安全有效的抗抑郁藥物已成為當(dāng)今亟待解決的問(wèn)題。柴胡皂苷A(Saikosaponin A,SA)是從中藥柴胡的干燥根中提取的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物,具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及保護(hù)肝臟的功效。目前研究初步證實(shí)SA具有一定的抗抑郁作用,但是其具體作用機(jī)理仍不明確。所以,深入探究SA的抗抑郁作用機(jī)理,可為開(kāi)發(fā)新的安全有效的抗抑郁藥物提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的尋求SA發(fā)揮抗抑郁作用的靶標(biāo)蛋白,闡明其抗抑郁作用機(jī)制,為開(kāi)發(fā)新型抗抑郁藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.采用慢性輕度不可預(yù)知性應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備抑郁大鼠模型,并以灌胃方式進(jìn)行給藥。將45只大鼠隨機(jī)分為 Control 組(C 組,15)、CUMS 組(M 組,15)、CUMS+SA 組(SA 組,15)。整個(gè)模型制備過(guò)程持續(xù)10周,第1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng),第2-9周進(jìn)行應(yīng)激刺激(刺激4周后開(kāi)始給藥,持續(xù)給藥4周,給藥的同時(shí)刺激不停止),第10周依據(jù)敞箱實(shí)驗(yàn)、糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估模型的制備情況。2.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠,分離海馬組織。3.采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(High performance liguid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)技術(shù)測(cè)定海馬組織中的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì):多巴胺(Dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)的含量。4.利用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric lags for relative and absolute quantification,iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選應(yīng)激前后及服用SA前后的大鼠海馬組織內(nèi)的差異表達(dá)蛋白。5.選取與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān)的靶標(biāo)蛋白-富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2,PRRT2)作為進(jìn)一步的研究對(duì)象,利用Western Blotting技術(shù)在組織水平上對(duì)PRRT2的表達(dá)量進(jìn)行初步驗(yàn)證。6.在細(xì)胞水平,進(jìn)一步探究SA對(duì)接受應(yīng)激刺激的神經(jīng)細(xì)胞是否具有一定程度的保護(hù)作用。采用皮質(zhì)酮刺激PC12細(xì)胞的方法制備抑郁癥細(xì)胞模型,然后利用CCK8法檢測(cè)SA對(duì)應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞成活率的影響,并采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)SA對(duì)應(yīng)激損傷的PC 12細(xì)胞內(nèi)蛋白PRRT2表達(dá)量的影響。結(jié)果1.長(zhǎng)達(dá)8周的CUMS結(jié)合孤養(yǎng)的方法可以成功建造大鼠抑郁模型。受刺激的大鼠會(huì)產(chǎn)生一系列的抑郁樣癥狀.:食欲下降,體重增長(zhǎng)減慢,活動(dòng)量下降,對(duì)糖水的偏嗜性降低,行為絕望等。2.M組大鼠海馬組織內(nèi)的DA含量相對(duì)C組顯著降低,SA組大鼠海馬內(nèi)DA的含量相對(duì)于M組則明顯提高,C組與SA組之間無(wú)顯著差別。3.定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示應(yīng)激前后共有391種蛋白發(fā)生了顯著性差異表達(dá),接受應(yīng)激刺激的大鼠在服用SA后有82種蛋白表達(dá)有顯著性差異。包括PRRT2在內(nèi)的15種蛋白的表達(dá)量不僅在刺激前后而且在用藥前后均發(fā)生了明顯的差異性改變。4.Western Blotting結(jié)果顯示M組大鼠海馬組織內(nèi)PRRT2含量相對(duì)C組顯著降低,SA組大鼠海馬內(nèi)的PRRT2含量相對(duì)于M組則有顯著性的提升。該結(jié)果與iTRAQ結(jié)果一致。5.400μM的皮質(zhì)酮刺激能夠顯著抑制PC12細(xì)胞的增殖、降低細(xì)胞的成活率,5μmol的SA則能夠顯著地減輕皮質(zhì)酮對(duì)PC12增殖的抑制作用,提高細(xì)胞成活率,減輕皮質(zhì)酮刺激對(duì)PC12的損傷作用。6.皮質(zhì)酮刺激能夠下調(diào)PC12細(xì)胞內(nèi)PRRT2的表達(dá)量,5μmol的SA具有上調(diào)PRRT2的趨勢(shì)。結(jié)論:1.長(zhǎng)期的慢性不可預(yù)知性應(yīng)激能夠降低海馬組織內(nèi)的DA含量,進(jìn)而引起一系列抑郁樣癥狀。2.SA可以上調(diào)DA含量,緩解抑郁樣癥狀,具有較明顯的抗抑郁效果。3.PRRT2參與調(diào)控突觸囊泡的融合和釋放過(guò)程,該蛋白能夠促進(jìn)DA等神經(jīng)遞質(zhì)的快速釋放過(guò)程,其表達(dá)量的降低會(huì)減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量。因此我們推斷,SA可能是通過(guò)上調(diào)PRRT2的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)DA的釋放,從而發(fā)揮抗抑郁作用。4.SA可減輕應(yīng)激刺激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷,具有一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。
【圖文】：

１邋ＣＵＭＳ成功誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為逡逑１．１大鼠抑郁模型制備過(guò)程流程圖逡逑圖１Ａ是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組和處理情況示意圖，４５只大鼠被隨機(jī)分為３組：逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋組（Ｃ邋組，１５）、ＣＵＭＳ邋組（Ｍ邋組，１５）、ＣＵＭＳ＋ＳＡ邋組（ＳＡ邋組，１５）。逡逑其中Ｃ組大鼠正常合籠飼養(yǎng)（５只／籠），Ｍ組和ＳＡ組大鼠接受為期８周的逡逑慢性應(yīng)激刺激。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的第５周時(shí)ＳＡ組給予ＳＡ灌胃治療，Ｍ組逡逑和Ｃ組給予同等體積（２ｍｌ）的生理鹽水。圖１Ｂ是制備大鼠抑郁模型的流逡逑程圖，整個(gè)模型制備過(guò)程共需１０周。第１周適應(yīng)性飼養(yǎng)；第２－９周進(jìn)行慢逡逑性應(yīng)激刺激，在第５周時(shí)給予ＳＡ灌胃治療，治療的同時(shí)刺激并不停止；第逡逑１０周進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離海馬組織。逡逑Ａ邐邐邐邋邐邋邐邐＾邐ＣＵＭＳ（－）逡逑￣￣＞邐ｓａ（－）逡逑Ｓａｌｉｎｅ（＋）逡逑＾邋（４５）邐１邋Ｓａｌｉｎｅ（Ｖ）逡逑＼＾ＣＵＭＳ＋ＳＡ＾Ｎ邐邋ＣＵＭＳ（＋）逡逑Ｖ＾＿（ＳＡ

ＫＥＧＧ邋Ｐａｔｈｗａｙｓ邋（Ｔｏｐ邋２０）逡逑圖５Ｂ邋Ｍ／Ｃ差異表達(dá)蛋白的ＫＥＧＧ通路富集分析逡逑圖５Ｂ：邋Ｍ組大鼠和Ｃ組大鼠海馬組織內(nèi)差異表達(dá)蛋白的ＫＥＧＧ通路富集分逡逑析結(jié)果（Ｃ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋組，Ｍ：邋ＣＵＭＳ邋組）。逡逑Ｆｉｇ．５Ｂ：邋Ｔｈｅ邋ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋Ｍ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋Ｃ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑４．２篩選出８２種可能受ＳＡ調(diào)控的蛋白逡逑同樣利用ｉＴＲＡＱ技術(shù)，在Ｍ組和ＳＡ組之間共篩選出４７７５種差異表達(dá)蛋白。逡逑按照變化倍數(shù)＞１．２倍且ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５的標(biāo)準(zhǔn)，，進(jìn)一步篩選出８２種蛋白在Ｍ逡逑組和ＳＡ組之間發(fā)生了顯著性地差異表達(dá)。這些蛋白中有２３種表達(dá)量增加，逡逑５９種表達(dá)量下降。其具體信息見(jiàn)于附表２。Ｇｏ注釋富集分析顯示這８２種蛋逡逑白在細(xì)胞組分方面主要參與構(gòu)成細(xì)胞膜、細(xì)胞器、突觸和突觸的部分結(jié)構(gòu)等；逡逑在分子功能方面這些蛋白具有結(jié)合綁定功能、催化活性、核酸綁定功能和轉(zhuǎn)逡逑錄因子活性等；在生物學(xué)過(guò)程方面主要參與調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程和逡逑生物新陳代謝過(guò)程等。ＧＯ注釋富集分析的詳細(xì)信息見(jiàn)于圖５Ｃ。鑒定出的８２逡逑３０逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉瓊珍;呂文婷;蔡e

本文編號(hào)：2682935