【摘要】：目的通過體外實驗研究丹皮酚對人鼻咽癌細胞株CNE-1的增殖抑制作用,并運用現(xiàn)代生物分子學實驗方法初步探討丹皮酚誘導CNE-1凋亡的內在機制(Bax和Bcl-2蛋白),為臨床治療鼻咽癌能夠增加一種新的低毒、高效的中藥治療藥物提供初步的實驗基礎。方法1四甲基偶氮唑鹽(MTT)法:檢測丹皮酚對人鼻咽癌CNE-1細胞增殖活性的影響。將丹皮酚用完全培養(yǎng)基稀釋為不同的劑量(0.006mol/L、0.012 mol/L、0.024mol/L),按照選取的不同時間長度24h、48h和72h分別用藥于CNE-1細胞,并以陰性對照組和陽性對照組作對比,觀察顯微鏡下各組細胞的形態(tài)變化,通過測量的吸光度值計算丹皮酚對CNE-1的增殖抑制率,并通過統(tǒng)計分析方法分析其結果。2免疫熒光染色法(AO/EB):觀察丹皮酚誘導CNE-1凋亡后的細胞形態(tài)變化。將丹皮酚低、中劑量組和CNE-1陰性組分別培養(yǎng)24h和48h后,收集并洗滌細胞,用AO/EB熒光染色,在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞是否有凋亡的形態(tài)變化。3流式細胞檢測術:檢測丹皮酚誘導CNE-1凋亡后細胞凋亡率和細胞生長周期的變化。將丹皮酚低、中劑量組和CNE-1陰性組分別培養(yǎng)48h后,收集并洗滌細胞,分別采用Annexin V-FITC、PI雙染法和PI單染法檢測細胞凋亡率和細胞生長周期的變化,并用統(tǒng)計軟件分析其結果。4免疫印跡法(Western Blot):檢測細胞內凋亡相關基因Bax和Bcl-2的表達情況。將丹皮酚低、中劑量組和CNE-1陰性組分別培養(yǎng)48h后分別收集細胞并提取蛋白,采用免疫印跡技術檢測Bax和Bcl-2的相對表達量,并用統(tǒng)計軟件分析其結果。結果1 MTT檢測結果:通過和陰性組作比較,丹皮酚能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細胞的增殖活性,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P㩳0.001),并隨著用藥劑量的增加和用藥時間的延長,抑制率升高,線性回歸分析有統(tǒng)計學意義(P㩳0.001)。2 AO/EB熒光染色結果:倒置顯微鏡下觀察,與陰性組呈現(xiàn)全視野綠色圓勻的正常CNE-1細胞形態(tài)對比,丹皮酚低中劑量用藥組均呈現(xiàn)出一定比例的橘黃色凋亡形態(tài)細胞,甚至可見呈橘紅色的固縮和新月形細胞,并且中劑量用藥組橘黃色細胞的比例高于低劑量用藥組,誘導CNE-1 48h后的橘黃色細胞比例高于誘導CNE-124h后。3流式細胞儀結果:(1)丹皮酚低、中劑量用藥組CNE-1細胞總凋亡率均高于陰性組,并且中劑量組高于低劑量組,差異顯著有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.001);(2)丹皮酚低、中劑量用藥組S期細胞數(shù)目比值均高于CNE-1陰性組,并且中劑量用藥組S期細胞數(shù)目的比值高于低劑量用藥組,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.01)。4免疫印跡結果:CNE-1細胞內Bax蛋白的表達量隨著丹皮酚用藥劑量的增加其相對表達量增加,Bcl-2正好相反,隨著丹皮酚用藥劑量的增加Bcl-2的相對表達量減少,通過統(tǒng)計分析,其結果差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P㩳0.01)。結論1丹皮酚具有抑制人鼻咽癌細胞CNE-1增殖活性的作用,并具有用藥時間相關性和用藥劑量依賴性。2丹皮酚抑制人鼻咽癌CNE-1細胞增殖的機制可能與生長周期阻滯于S期和細胞凋亡有關,并且生長周期阻滯于S期也可能會引發(fā)細胞凋亡。3丹皮酚誘導CNE-1細胞凋亡的作用,可能與Bax相對表達量上調和Bcl-2相對表達量降低有關,這可能與線粒體凋亡通路有關,有待進一步研究探討。
【圖文】：

2 熒光染色顯微鏡下觀察細胞形態(tài)（AO/EB）正常的 CNE-1 陰性對照組細胞熒光下見其細胞核染色質被著染成綠色，形圓質勻結構正常；而丹皮酚用藥組鏡下可見三種顏色，綠色、橘黃色和紅色，并且部分形態(tài)結構異常。其中丹皮酚中劑量組著橘黃色和紅色的細胞數(shù)量多于低劑量組，呈碎塊狀，并且隨著時間延長見各用藥組被著染為橘黃色的細胞數(shù)量增多（附圖 1）。3 FCM 測定細胞凋亡率和周期變化3.1 FCM 檢測細胞凋亡率只被 AnnexinV-FITC 染色的為早期凋亡細胞（附圖 2，見 Q3 象限），能同時被 AnnexinV-FITC 和 PI 染色的為晚期凋亡細胞（見 Q2 象限），只能被 PI 染色的

異具有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。說明丹皮酚能夠誘導 CNE-1 細胞凋亡。線性析劑量效應關系顯著(P < 0.05)，具有劑量依賴性（表 2、圖 2）。表 2 Pae 作用于 CNE-1 細胞凋亡率的變化（處理 48h,%）（x—±s,n=3）組 別 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡陰性對照 2.636±0.325 3.483±0.185 6.120±0.Pae 低劑量 16.133±0.569* 5.337±0.360* 21.470±0Pae 中劑量 14.533±2.554* 16.967±1.290* 31.400±2注：與陰性組凋亡率相比，* P㩳0.05，△P㩳0.001。
【學位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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1 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Hongmei Zeng;Siwei Zhang;Jie He;;Annual report on status of cancer in China, 2011[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

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本文編號：2682603