【摘要】：目的:1、研究NC和SN38對(duì)HT29細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用,NC阻斷SN38誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)和引起DNA損傷。2、探討NC阻斷DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)制。3、評(píng)價(jià)NC對(duì)HT29細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法:1、以人結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞作為受試對(duì)象,通過(guò)NC和SN38聯(lián)合用藥,采用MTT和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡變化,評(píng)價(jià)不同濃度的NC和SN38對(duì)HT29細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用。2、采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC和SN38對(duì)HT29細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)情況,western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞p-H2AX的蛋白表達(dá)。3、以western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Eme1、p-Src(Tyr419)、Stat3、p-Stat3(Tyr705)、p-Stat3(Ser727)蛋白的表達(dá),深入探討NC引起DNA損傷和阻斷SN38誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的分子機(jī)制。4、以慢病毒載體成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Eme1的HT29細(xì)胞系,采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC和SN38對(duì)細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)情況,western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC對(duì)Eme1蛋白表達(dá)影響。5、以CCK8和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同濃度的NC對(duì)HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡作用。6、采用western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cyt-c和caspase-3的蛋白表達(dá),進(jìn)一步探究NC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。結(jié)果:1、NC和SN38對(duì)HT29細(xì)胞的抑制率增大,并且促進(jìn)HT29細(xì)胞凋亡,與單獨(dú)SN38給藥組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SN38單獨(dú)給藥時(shí),彗星尾長(zhǎng)不明顯;而當(dāng)NC和SN38聯(lián)合給藥時(shí),隨著NC濃度的增大,彗星尾長(zhǎng)和尾部DNA含量顯著增大,與單獨(dú)SN38給藥組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NC和SN38聯(lián)合給藥時(shí),p-H2AX蛋白表達(dá)水平均顯著升高,與單獨(dú)SN38給藥組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SN38單獨(dú)給藥時(shí),Eme1、p-Src(Tyr419)、Stat3、p-Stat3(Tyr705)、p-Stat3(Ser727)蛋白表達(dá)水平均顯著升高,與溶劑對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而NC和SN38聯(lián)合給藥時(shí),上述的五種蛋白水平均明顯下降,與單獨(dú)SN38給藥組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、熒光顯微鏡下觀察HT29細(xì)胞獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Eme1在HT29細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SN38單獨(dú)給藥時(shí),彗星尾長(zhǎng)不明顯;而當(dāng)NC給藥時(shí),彗星尾長(zhǎng)和尾部DNA含量顯著增大,與Eme1-OV組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NC下調(diào)了Eme1的蛋白表達(dá)水平。5、與溶劑對(duì)照組比較,隨著NC濃度增加,HT29細(xì)胞的抑制率逐漸增大,細(xì)胞凋亡率增大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Cyt-c和caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高,與溶劑對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、NC和SN38對(duì)HT29細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用,NC可以下調(diào)Eme1的蛋白表達(dá),阻斷DNA損傷修復(fù),從而加重DNA損傷。2、NC阻斷DNA損傷修復(fù)途徑可能與抑制Src-Stat3信號(hào)通路有關(guān)。3、NC能夠抑制HT29細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡,其分子機(jī)制可能與Cyt-c/caspase-3介導(dǎo)的線粒體內(nèi)部凋亡途徑有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 NC 和 SN38 對(duì) HT29 細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 1-1 The inhibition effect of NC and SN38 on HT29 cells1 or ***P<0.001, vs 24h SN38 group;＃＃＃P<0.001, vs 48h SN38 group;△△△P<0.001 Svs control group.們進(jìn)一步應(yīng)用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證對(duì) HT29 細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用。流式細(xì)胞檢測(cè)儀分析結(jié)果表明給藥 48h 時(shí)細(xì)胞凋亡比例是 12.95±7.19%，而 NC (30 和 60μM)藥 48h 時(shí)，凋亡率分別增加至 22.67±3.82% 和 28.33±6.84%，給藥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖 1-2。結(jié)果說(shuō)38 具有協(xié)同誘導(dǎo) HT29 細(xì)胞凋亡的作用。

26圖 1-2 NC 和 SN38 對(duì) HT29 細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞檢測(cè)圖 B. 細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)柱形圖（ x±s, n=Fig. 1-2 Effect of NC and SN38 on apoptosis in HT29 cellsection of apoptosis using Annexin V-FITC/PI B. Statistical histograms of the apoptosis ( x±s, n=3)*P<0.05 or **P<0.01, vs SN38 group.實(shí)驗(yàn)檢測(cè) NC 與 SN38 聯(lián)合用藥對(duì) HT29 細(xì)胞的 DNA 損 NC 是否阻斷了 SN38 引起的 DNA 損傷修復(fù)，我們采用NA 損傷的彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在堿性條件下電泳，帶負(fù)電在凝膠中遷移，經(jīng)熒光染料染色后，每一個(gè)損傷的細(xì)胞光頭部和尾部，，似彗星形狀。彗星的尾長(zhǎng)和尾部熒光強(qiáng)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

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