【摘要】：膽固醇依賴型細(xì)胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysins,CDCs)是多種革蘭氏陽(yáng)性病原菌在感染過(guò)程中分泌的一大類毒素,其典型特征是能在靶細(xì)胞上打孔,裂解多種細(xì)胞,因此也被稱為成孔毒素或溶血素。分泌CDCs的革蘭氏陽(yáng)性病原菌能引發(fā)人畜多種感染性疾病,如腦膜炎、菌血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、胃腸炎和壞死性腸炎等,嚴(yán)重威脅人類健康、畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和食品安全。40多種革蘭氏陽(yáng)性病原菌能在感染過(guò)程中分泌CDCs,其中單增李斯特菌細(xì)胞溶素(Listeriolysin O,LLO)、豬鏈球菌細(xì)胞溶素(Suilysin,SLY)和肺炎鏈球菌細(xì)胞溶素(Pneumolysin,PLY)分別由單核增生李斯特菌(L.monocytogenes)、豬鏈球菌(S.suis)和肺炎鏈球菌(S.pneumonia)分泌,是CDCs家族中典型代表性成員。研究表明細(xì)胞溶素在其病原菌感染過(guò)程中發(fā)揮多方面關(guān)鍵作用,如裂解多種細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露;促進(jìn)病原菌穿過(guò)血腦屏障,引發(fā)腦膜炎;幫助細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)清除作用;誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;降低機(jī)體免疫力,引發(fā)炎癥等,這些重要作用使其成為篩選抗分泌CDCs革蘭氏陽(yáng)性病原菌抗菌劑的重要靶點(diǎn)。此外,研究表明CDCs家族成員一級(jí)結(jié)構(gòu)有高度同源性、空間結(jié)構(gòu)存在高度相似性、有相似的成孔機(jī)制和相近的生物學(xué)功能,這些共同特征也為以CDCs為靶標(biāo)篩選廣譜抗毒力抑制劑奠定了基礎(chǔ)。本研究以CDCs家族中典型成員LLO、SLY和PLY為靶標(biāo),獲得食源性天然化合物白皮杉醇抑制劑,抗菌試驗(yàn)表明白皮杉醇在有效抑制成孔活性濃度條件下不影響病原菌的生長(zhǎng);蛋白免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白皮杉醇能直接抑制CDCs寡聚體的形成。細(xì)胞水平上,白皮杉醇顯著降低了分泌CDCs病原菌介導(dǎo)的細(xì)胞毒性及炎癥反應(yīng)。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白皮杉醇對(duì)單增李斯特菌感染小鼠表現(xiàn)出了系統(tǒng)性的保護(hù)作用,體現(xiàn)在降低感染小鼠死亡率,降低單增李斯特菌靶器官(脾臟和肝臟)細(xì)菌定植數(shù)和炎癥因子水平,緩解了炎癥反應(yīng)。基于計(jì)算生物學(xué)和生物化學(xué)方法探究并驗(yàn)證了白皮杉醇與CDCs作用機(jī)制。利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法獲得了白皮杉醇與CDCs穩(wěn)定復(fù)合物體系,分析了研究對(duì)象之間的具體結(jié)合模式、結(jié)合過(guò)程中氨基酸自由能貢獻(xiàn)、蛋白質(zhì)中各氨基酸殘基在結(jié)合白皮杉醇前后柔性的變化及氫鍵作用,發(fā)現(xiàn)白皮杉醇結(jié)合在CDCs家族成員第2結(jié)構(gòu)域與第4結(jié)構(gòu)域的交界處,結(jié)合后引發(fā)CDCs空間構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致第2結(jié)構(gòu)域與第4結(jié)構(gòu)域之間的夾角變大,第4結(jié)構(gòu)域不能充分與靶細(xì)胞膜上的膽固醇受體結(jié)合,阻礙了寡聚體的形成,引發(fā)了成孔活性的降低。天冬酰胺在白皮杉醇與CDCs成員蛋白的結(jié)合過(guò)程中貢獻(xiàn)了能量,精氨酸和酪氨酸僅在白皮杉醇與PLY和SLY的結(jié)合過(guò)程發(fā)揮了作用。白皮杉醇與PLY和SLY的結(jié)合過(guò)程中存在氫鍵作用,整個(gè)結(jié)合過(guò)程中氫鍵的穩(wěn)定性高于60%,表明氫鍵是SLY和PLY與白皮杉醇結(jié)合過(guò)程中重要分子間作用力,對(duì)復(fù)合物體系的穩(wěn)定提供重要作用。另外通過(guò)Lig Plus軟件和徑向分布函數(shù)分析發(fā)現(xiàn)白皮杉醇的間位羥基是氫鍵形成的關(guān)鍵基團(tuán),最后通過(guò)氨基酸定點(diǎn)突變、熒光淬滅和突變后結(jié)合自由能計(jì)算確證了分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果的可靠性和可信性。分子機(jī)制的探索和闡明為開(kāi)發(fā)抗CDCs病原菌廣譜抗菌劑提供了重要理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

動(dòng)物源大大增加了人感染的幾率，顯著增加了傳染源及傳播幾率[38]感染主要表現(xiàn)為持續(xù)高熱 41℃-43℃，精神萎靡，食欲不振，嗜睡等得不到適當(dāng)控制，將迅速發(fā)展為腦膜炎、菌血癥直至引發(fā)死亡[39]。豬鏈球菌感染呈世界范圍內(nèi)暴發(fā)，1954 年豬鏈球菌被發(fā)現(xiàn)為豬的病原 年，荷蘭學(xué)者首次報(bào)道豬鏈球菌引發(fā)人感染并導(dǎo)致腦炎。大量調(diào)查世界范圍內(nèi)已經(jīng)有 30 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)過(guò)豬鏈球菌的感染與流引發(fā)了約 1600 多人感染，并導(dǎo)致死亡案例發(fā)生[40]。北美的加拿大和的智利、阿根廷和法屬圭亞那都有人感染豬鏈球菌的案例報(bào)道[40]。國(guó)家都暴發(fā)過(guò)人感染 2 型豬鏈球菌感染病例，如意大利、法國(guó)、德、希臘、荷蘭、丹麥、葡萄牙等[41]。亞洲的泰國(guó)和越南也暴發(fā)過(guò)人菌病例且呈現(xiàn)出地方性特征[42]。2005 年和 1998 年中國(guó)四川暴發(fā)了人感染豬鏈球菌案例，數(shù)百人感染發(fā)病并導(dǎo)致數(shù)十人死亡，引起了球菌感染的高度重視[43]。

固醇依賴型細(xì)胞溶素與產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素 PFO 的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它們之間有極高的相似性（圖 1.2），在第三區(qū)域（domain 3, D3）都有一個(gè)包含兩個(gè)明顯 α-HBs（αHB1 和 αHB2）的 β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)，D3 位于 β-折疊中心的側(cè)面，，但是它們的晶體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)有兩個(gè)顯著的不同點(diǎn)，分別是：（1）第1-3 區(qū)域（domain 1-3，核心區(qū)域）和第 4 區(qū)域（domain 4，側(cè)區(qū)）之間有一個(gè)明顯的彎曲，也就是夾角，不同家族成員蛋白之間的夾角不同；（2）當(dāng)家族蛋白晶體在空間出現(xiàn)彼此重疊時(shí)，高度保守的 11-氨基酸肽環(huán)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，這一點(diǎn)在 PFO 和 ALO 中尤為明顯。正是由于這個(gè)高度保守的 11-氨基酸肽環(huán)結(jié)構(gòu)不會(huì)形成 3D 空間構(gòu)象，于是研究者推測(cè)這一序列在各個(gè)家族成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)也就是氨基酸序列中是高度保守的，后期研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)構(gòu)上的差異似乎并不是由于晶體結(jié)構(gòu)在空間折疊相互接觸引發(fā)的，很大的可能性是由于 11-氨基酸肽環(huán)結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基與鄰近結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基產(chǎn)生了多種分子間作用力引發(fā)的[108]。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285;Q939.92

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本文編號(hào)：2678288