【摘要】：帕金森病(parkinson's disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,其典型病變是在黑質(zhì)致密部、藍(lán)斑神經(jīng)元,上述部位多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元出現(xiàn)變性、凋亡、缺失。腦腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和多巴胺能(DA)神經(jīng)元退行性病變的進(jìn)展中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)通過血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與PD的病程有密切的關(guān)系,從而影響DA能神經(jīng)元的功能。Endophilin A2(EP2)參與快速內(nèi)皮素介導(dǎo)的胞吞作用(FEME)并迅速內(nèi)吞幾種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),而AT1R屬于GPCR家族,因此,EP2可能通過內(nèi)吞AT1R調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。雞豆黃素A(biochanin A,Bioch A)是一種異黃酮類植物雌激素,課題組前期研究表明Bioch A可以抑制由于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的活化,但AngII誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生激活,進(jìn)而引起DA能神經(jīng)元的凋亡,其作用還不明確。目的:研究Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷的改善作用及其機(jī)制。方法:采用隨機(jī)分組法將SD大鼠分成以下6組:假手術(shù)組、AngⅡ(5μg/3μl)模型組、Losartan對照組和雞豆黃素A不同濃度給藥組(AngⅡ+Bioch A(16mg/kg)、AngⅡ+Bioch A(32mg/kg)、AngⅡ+Bioch A(64mg/kg))。用腦部立體定位儀精準(zhǔn)定位在大鼠大腦黑質(zhì)致密部處,注射AngⅡ引發(fā)DA能神經(jīng)元的損傷狀態(tài)從而制備模型,假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。注射后24h蘇醒,Bioch A組按相應(yīng)濃度梯度灌胃給藥,Losartan組也灌胃給藥。注射后第7天,各組大鼠開始觀察各行為學(xué)指標(biāo)的改變。接著,各組大鼠腹腔注射阿樸嗎啡,檢測并記錄旋轉(zhuǎn)圈數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即斷頭處死,取組織待檢。采用免疫組織化學(xué)法(IHC-P),觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和DA能神經(jīng)元的狀態(tài),Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)、Endophilin A2(EP2)。采用免疫蛋白印跡法(western blot),檢測大腦黑質(zhì)致密部α-突觸蛋白(α-synuclein)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-likeprotein containing CARD,ASC)、gp91phox、p22phox、IL-1β(interleukin1β,L-1β)、IL-6(interleukin-6)、IL-18(interleukin-18,IL-18)、TNF-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)情況。結(jié)果:1)對模型大鼠行為學(xué)影響結(jié)果:與假手術(shù)組相比,AngⅡ組大鼠的自由活動(dòng)能力出現(xiàn)不同程度降低;與AngⅡ組相比,Bioch A組大鼠的自發(fā)活動(dòng)及探索行為均有不同程度提高。2)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)結(jié)果:AngⅡ組大鼠腹腔注射阿撲嗎啡出現(xiàn)向健康側(cè)旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象,且Bioch A組旋轉(zhuǎn)次數(shù)少于AngⅡ組。3)對模型大鼠病理學(xué)影響:假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)致密部中DA能神經(jīng)元飽滿且數(shù)目多,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)處于沉默狀態(tài);而AngⅡ組,DA能神經(jīng)元大多形態(tài)發(fā)生變化最后凋亡、缺失,胞體萎縮,同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯增多,呈“阿米巴樣”;與AngⅡ組相比,Bioch A組減少了小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量和降低DA能神經(jīng)元損傷程度。4)對模型大鼠NLRP3炎癥小體影響:AngⅡ組NLRP3蛋白表達(dá)升高,而Bioch A組降低了NLRP3表達(dá)量;Western blot觀察結(jié)果:AngⅡ組Caspase-1和ASC蛋白表達(dá)量升高,Bioch A組顯著降低Caspase-1和ASC蛋白表達(dá)水平。5)對模型大鼠氧化亞基的影響:AngⅡ組gp91phox和p22phox表達(dá)量升高,但Bioch A組降低了gp91phox和p22phox表達(dá)量。6)對模型大鼠炎癥因子的影響:AngⅡ組IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表達(dá)量升高,Bioch A組降低IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α。7)對模型大鼠吞蛋白和AT1R的影響:AngⅡ組EP2表達(dá)降低,AT1R表達(dá)升高,但Bioch A組促進(jìn)EP2蛋白表達(dá),降低AT1R表達(dá)水平。結(jié)論:Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元損傷模型大鼠具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與Bioch A抑制AngII誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,通過抑制NADPH氧化酶和NLRP3炎癥小體的活性,其進(jìn)一步機(jī)制可能與EP2和AT1R之間的相互作用有關(guān)。
【圖文】：

5. 結(jié)果5.1 雞豆黃素A對AngⅡ誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元損傷模型大鼠自發(fā)活動(dòng)和行為學(xué)影響阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與假手術(shù)組相比，AngⅡ組旋轉(zhuǎn)數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.01）；與 AngⅡ組相比，Bioch A 給藥組旋轉(zhuǎn)數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.01 或 p < 0.05）。行為學(xué)指標(biāo)顯示，與假手術(shù)組相比，AngⅡ組大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)穿過虛擬網(wǎng)格數(shù)，運(yùn)動(dòng)軌跡長度和前肢離地?cái)?shù)全都有所減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p< 0.01 或 p < 0.05）;與 AngⅡ組相比，Bioch A組的運(yùn)動(dòng)軌跡長度和前肢離地?cái)?shù)均有不同程度提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.01 或 p < 0.05）。提示 Bioch A 能改善 AngⅡ誘導(dǎo)的 DA 能神經(jīng)元損傷模型大鼠的自發(fā)活動(dòng)及探索行為能力，，如圖 1 所示。

29圖 2 雞豆黃素 A 對 AngⅡ誘導(dǎo)的 DA 神經(jīng)元損傷模型大鼠在黑質(zhì)致密部小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 （n=4）Fig.2 Effects of biochanin A on microglial activation in the SNpc of AngⅡ-inducedDA neuronal damage rats. Representative imagines showing Bioch A inhibitsmicroglial activation and morphological changes in the SNpc of AngⅡ-induced DAneuronal damage rats (immunohistochemistry) (a). The bar is 100 μm. A sham group;B AngⅡ group; C Losartan group; D, E, F Biochanin A (16, 32, 64 mg/kg) group.Quantitative analysis of Iba1 positive expression in the SNpc (b). Results areexpressed as means ± SD (n=4). **p<0.01 vs the sham group,△p<0.05,△△p<0.01 vsthe AngⅡ-treated group.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2677205