【摘要】：第一部分【研究背景】慢性腦缺血(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)為臨床常見病、多發(fā)病,致死率、致殘率高,可導致認知功能障礙,嚴重危害人類健康。迄今為止,CCH導致認知功能障礙的發(fā)病機理不完全清楚,尚無特效藥物和治療手段,因此,CCH導致認知功能障礙的發(fā)病機制與防治是神經(jīng)科學關注的焦點。CCH發(fā)病機制復雜,其主要的病理過程包括缺血導致細胞能量缺失、細胞壞死和凋亡、腦白質損傷、血腦屏障破壞、脂質代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂,神經(jīng)發(fā)生受損等。神經(jīng)發(fā)生即新的神經(jīng)元產(chǎn)生的過程,包括神經(jīng)干細胞的增殖、遷移、分化,最終新生成的神經(jīng)元并整合到局部神經(jīng)環(huán)路。臨床上中風患者數(shù)周至數(shù)月后癥狀有所改善,部分得益于腦部這種內(nèi)在的修復機制,因此促進腦缺血損傷后的神經(jīng)發(fā)生對其治療有重要意義。當腦組織受到損傷或炎癥等刺激時,局部微環(huán)境發(fā)生改變,神經(jīng)干細胞即被活化,進而增殖、遷移、分化產(chǎn)生新的神經(jīng)元,發(fā)揮代償和修復功能。眾多因素影響CCH時的神經(jīng)發(fā)生,其中核受體超家族重要成員——肝X受體(Liver X receptors,LXRs),在神經(jīng)發(fā)生中的地位日益受到關注。LXRs包括兩種亞型——LXRα和LXRβ。LXRα主要表達在肝臟、腎臟、小腸、脾臟、脂肪組織等參與外周脂質代謝的器官;LXRβ表達十分廣泛,其中肝臟和大腦的表達水平最高。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中,LXRs是最主要的維持膽固醇平衡和抗炎的因子。膽固醇代謝失調參與眾多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病,尤其在CCH發(fā)生發(fā)展的過程扮演重要角色,通過調節(jié)或糾正脂質代謝紊亂,有可能用于CCH的臨床治療。研究表明,LXRα和LXRβ作為抗炎轉錄因子,參與先天免疫和適應性免疫應答,亦可作為細胞凋亡和吞噬的生理調節(jié)劑。來自細胞凋亡時細胞膜破裂的膽固醇衍生物,作為LXRs激動劑發(fā)揮抗凋亡的作用。已有研究證實,LXRs受體激動劑GW3965可劑量依賴性地促進神經(jīng)干細胞增殖,提示LXRs可能參與了神經(jīng)發(fā)生,推測可能在改善CCH導致的認知障礙中也發(fā)揮著重要的作用。因此,LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點具有非常重要的意義�！狙芯磕康摹恳阅X內(nèi)LXRs為研究對象,探討LXRs參與CCH的發(fā)病機制、激活LXRs改善CCH引起的學習記憶障礙的分子機制。擬通過闡明LXRs激動劑GW3965提高神經(jīng)元的存活、促進神經(jīng)干細胞的增殖,從而改善CCH引起的學習記憶障礙的研究機制。該研究為治療CCH提供新靶點,為臨床研究提供思路和理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1.免疫熒光法觀察LXRα、LXRβ在海馬是否有特異性表達、分布;進一步通過LXRβ與神經(jīng)元/膠質細胞標志物(Neu N/GFAP)雙標共染確定LXRs分布的細胞特異性,將LXRβ與抑制性/興奮性神經(jīng)元標志物(GABA/VGLUT2)雙標染色確定表達的神經(jīng)元類型。2.微彈簧圈法造成雙側頸動脈狹窄(Bilateral carotid stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宮行為學評價CCH是否能夠導致小鼠學習記憶功能障礙,進而給予GW3965治療15 d是否可改善CCH導致的小鼠學習記憶障礙。3.給予或不給予GW3965治療,觀察HE染色小鼠的PFC(Prefrontal cortex)、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化。4.采用Western blot的方法,檢測CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRs不同亞型表達水平的變化。5.采用Western blot的方法,檢測該模型小鼠腦內(nèi)谷氨酸離子型受體與凋亡信號通路上相關蛋白表達的變化;并觀察給予GW3965治療后是否逆轉這些蛋白的表達。6.體外培養(yǎng)神經(jīng)元,建立氧糖剝奪模型(OGD)模擬CCH模型,利用MTT檢測不同時間梯度Co Cl2對細胞存活率的影響,以及給予不同濃度梯度GW3965細胞存活率的變化。7.Brd U摻入(100 mg/kg i.p,連續(xù)3 d)、染色法觀察CCH建模30 d小鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的變化,給予GW3965治療CCH小鼠,DG區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的變化。8.體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞,首先采用免疫熒光雙標技術觀察LXRα、LXRβ與神經(jīng)干細胞標志物Nestin是否共表達;并觀察給予不同濃度梯度GW3965處理后是否會濃度依賴性的促進神經(jīng)干細胞增殖。9.設計并包裝生產(chǎn)LXRα、LXRβ慢病毒載體(sh LXRα、sh LXRβ);通過免疫熒光和Western blot驗證sh LXRα、sh LXRβ體外感染神經(jīng)干細胞的效率及下調LXRα、LXRβ表達水平的效果;10.sh LXRα、sh LXRβ、sh LXRα+sh LXRβ分別感染NSCs 72 h后,給予GW3965處理3 d,經(jīng)Brd U(100μg/ml,4 h)摻入后免疫熒光染色法分析細胞增殖的變化,明確GW3965促NSCs增殖效應的LXRs受體亞型。11.為探究PI3K/Akt信號通路在GW3965促NSCs增殖中的作用,首先Western blot法觀察GW3965對NSCs中Akt磷酸化的影響(時間依賴性和濃度依賴性);進而預先給予PI3K特異性抑制劑LY294002(20μM,2 h)處理,觀察GW3965對p-Akt表達水平的影響;最后,Brd U摻入法分析LY294002對GW3965促NSCs增殖效應的影響,明確GW3965是否通過PI3K/Akt信號通路促NSCs增殖效應�！狙芯拷Y果】1.免疫熒光染色結果顯示,LXRβ海馬區(qū)的表達多,LXRα在海馬區(qū)表達較少。2.Morris水迷宮結果顯示,與假手術組相比,CCH導致小鼠學習記憶障礙,表現(xiàn)為小鼠搜索平臺時間(潛伏期)延長,游泳距離增加,穿越平臺次數(shù)減少;與模型組相比,GW3965治療后,顯著改善CCH導致的小鼠學習記憶障礙。3.HE染色結果證實,與假手術組相比,模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結構不清晰,出現(xiàn)細胞核固縮和大量細胞凋亡;與模型組相比,給予GW3965治療后神經(jīng)元的形態(tài)結構與正常相似,細胞凋亡的比例下降。4.Western blot結果顯示,與假手術組相比,CCH模型小鼠PFC、CA1中LXRβ表達水平顯著下調,LXRα表達水平的變化不明顯。5.Western blot結果表明,與假手術組相比,CCH模型小鼠海馬中谷氨酸離子型受體——NMDAR的亞基Glu N2B表達水平增加而Glu N2A基本不變,AMPAR的Glu R1亞基絲氨酸831、845位點磷酸化減少,同時,凋亡信號通路中Bax、PARP表達增加而Bcl-2表達下降;給予CCH小鼠GW3965治療后,可以逆轉上述這些蛋白表達的變化。6.以Co Cl2(200μM)孵育培養(yǎng)的神經(jīng)元模擬氧糖剝奪病理條件,MTT檢測結果發(fā)現(xiàn),Co Cl2干預后神經(jīng)元存活呈時間依賴性降低,大約50%細胞于缺氧12 h時死亡;給GW3965處理后發(fā)現(xiàn),GW3965濃度依賴性提高細胞的存活。7.采用Brd U摻入免疫熒光染色法分析NSCs的增殖,結果顯示,與假手術組相比,CCH小鼠DG區(qū)Brd U陽性的NSCs數(shù)目顯著減少,提示CCH中NSCs增殖受損;給予GW3965治療后,與CCH組相比,GW3965恢復CCH小鼠DG區(qū)NSCs的增殖,提示GW3965具有促NSCs增殖的作用。8.體外培養(yǎng)NSCs,免疫熒光雙標法觀察NSCs中LXRα、LXRβ的表達,發(fā)現(xiàn)LXRα、LXRβ與NSCs標志物Nestin共存;給予不同濃度LXRs的激動劑GW3965處理,發(fā)現(xiàn)GW3965濃度依賴性的促進神經(jīng)干細胞增殖。9.包裝生產(chǎn)LXRα/LXRβ的慢病毒載體;免疫熒光和Western blot顯示,sh LXRα、sh LXRβ高效感染神經(jīng)干細胞,并顯著下調LXRα、LXRβ表達水平。10.分別以sh LXRα、sh LXRβ感染NSCs下調蛋白表達水平,采用Brd U摻入熒光染色法發(fā)現(xiàn),如前給予GW3965處理3 d后,sh LXRβ轉染后GW3965促NSCs增殖效應被取消,而sh LXRα轉染后不影響GW3965促NSCs增殖作用,提示GW3965促NSCs增殖效應通過激活LXRβ而非LXRα實現(xiàn)。11.Western blot結果顯示,GW3965時間、濃度依賴性增加NSCs中Akt磷酸化水平,其中GW3965刺激NSCs 15 min(10μM)或10μM(15 min)時,Akt的磷酸化即達高峰;給予NSCs預處理LY294002(20μM)2 h,GW3965磷酸化Akt的效應則消失,相應的GW3965促NSCs增殖作用亦被取消,提示GW3965促進NSCs增殖的效應與PI3K/Akt信號通路活化相關�！狙芯拷Y論】本研究證實,通過微彈簧造成雙側頸動脈狹窄成功建立小鼠CCH模型,CCH導致小鼠學習記憶障礙;給予CCH小鼠GW3965治療,可改善CCH小鼠的學習記憶障礙。深入的機制研究發(fā)現(xiàn),GW3965通過抑制凋亡信號通路提高神經(jīng)元的存活;同時,GW3965通過激活LXRβ,進而活化PI3K/Akt信號通路促進NSCs增殖參與CCH神經(jīng)發(fā)生。研究結果提示,激活LXRs提高CCH發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)元的存活、促進NSCs增殖,從而改善CCH導致的學習記憶障礙。因此,LXRs可能作為CCH潛在的治療新靶點。第二部分【研究背景】慢性炎性痛(Chronic inflammatory pain)是一種與組織損傷或潛在的損傷相關的不愉快的主觀感覺和情感體驗,能夠誘發(fā)不良情緒,使患者的病情加重。研究證實,前扣帶皮層(Anterior cingulate cortex,ACC)是大腦的疼痛處理區(qū)之一,是痛覺調節(jié)的重要組成部分。已證實,慢性痛潛在的機制包括ACC區(qū)神經(jīng)元過度興奮以及膠質細胞的激活,其中,膠質細胞的激活導致炎癥的級聯(lián)反應是誘發(fā)慢性痛的重要原因。天麻素(Gastrodin,GAS)是從天麻中分離出的主要活性成分之一,具有鎮(zhèn)痛、促智、抗炎作用。因此,GAS可能作為慢性炎性痛潛在的治療藥物具有非常重要的意義�！狙芯磕康摹縂AS對改善CFA誘發(fā)慢性炎性痛小鼠行為學的影響,擬通過闡明GAS改善CFA引起的慢性炎性痛及具有抗焦慮效應,抑制炎癥信號蛋白的過表達,從而發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用的研究機制。為臨床治療慢性炎性痛提供思路和理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā勘緦嶒炌ㄟ^檢測機械痛閾值與熱痛閾值,觀察給予GAS后CFA誘導的慢性炎性痛小鼠的行為學變化。高架十字迷宮(Elevated plus-maze test,EPM)和曠場實驗(Open field test,OFT)檢測給予GAS后,慢性炎性痛誘導的焦慮樣行為的改變。免疫熒光觀察小鼠ACC區(qū)星形膠質細胞與小膠質細胞的活化情況,Western blot觀察ACC區(qū)神經(jīng)可塑性蛋白與炎性相關的蛋白表達變化�！狙芯拷Y果】GAS能顯著緩解CFA誘導的小鼠慢性炎性痛和伴隨的焦慮樣行為。GAS治療后,降低CFA小鼠ACC區(qū)NMDAR亞基Glu N2A與Glu N2B、AMPAR亞基Glu R1及Ca MKII-α表達的上調,提示與神經(jīng)可塑性相關的關鍵分子參與慢性炎性痛及其伴隨的焦慮樣行為。此外,GAS減少CFA小鼠ACC區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞的活化,降低與炎癥相關信號蛋白p-JNK和p-P38,IL-6和TNF-α的表達,提示GAS可能通過調控炎癥通路的活化發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用�！狙芯拷Y論】研究證明,GAS抑制CFA小鼠ACC區(qū)星型膠質細胞與小膠質細胞的活化,并通過逆轉了與神經(jīng)可塑性相關的Glu N2A,Glu N2B、Glu R1和Ca MKII-a,及炎癥信號相關蛋白磷酸化JNK和P38,IL-6和TNF-α的表達,改善CFA誘發(fā)慢性炎性痛小鼠行為。因此,GAS可能作為臨床治療慢性炎性痛的潛在藥物。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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2676238
