發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 02:59

【摘要】：梔子是一味重要的中藥材,又名山梔子,是茜草科植物山梔的果實(shí),其中梔子果實(shí)的主要有效成分為山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物。梔子和淡豆豉是傳統(tǒng)中藥配伍中的一對(duì)經(jīng)典藥對(duì),廣泛應(yīng)用于臨床研究中。其中,淡豆豉的主要活性成分為異黃酮。異黃酮是一種結(jié)構(gòu)與雌激素相似的生物活性化合物,被稱為植物雌激素。課題組前期研究飲食中的異黃酮對(duì)淡豆豉體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)異黃酮可能通過(guò)調(diào)控腸道菌上調(diào)β-葡萄糖苷酶的活性從而促進(jìn)糖苷向苷元的脫糖代謝。由于梔子中環(huán)烯醚萜苷的體內(nèi)代謝過(guò)程也受β-葡萄糖苷酶的調(diào)控,所以本文通過(guò)大鼠灌胃不同時(shí)間的異黃酮,研究了異黃酮對(duì)梔子中環(huán)烯醚萜苷成分藥代動(dòng)力學(xué)特征的影響。為了分析梔子中主要環(huán)烯醚萜苷,首先建立了梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷三種環(huán)烯醚萜苷成分的定性定量分析方法。接著建立了大鼠口服梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后血漿中的山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和代謝產(chǎn)物京尼平的定性定量分析方法。隨著異黃酮暴露時(shí)間的增加,研究腸道菌介導(dǎo)的腸代謝受影響的程度,并通過(guò)比較四種物質(zhì)在異黃酮暴露不同時(shí)間的大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為,研究了異黃酮對(duì)環(huán)烯醚萜苷在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響。本課題開(kāi)展了以下五個(gè)方面的研究:一、梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷的定量分析本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜成分含量的LC-MS/MS法。該方法具有良好的選擇性、靈敏度、精密度,證明該方法適用于梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷的定量分析研究。色譜條件為反向C_(18)柱(100 mm×4.6 mm,5μm),使用梯度洗脫,流動(dòng)相為0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈(B),流速為0.4 ml/min,分析時(shí)間5 min;質(zhì)譜條件為電噴霧離子化電離源,正離子(京尼平龍膽雙糖苷)和負(fù)離子(山梔苷和梔子苷)切換模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。樣品符合線性關(guān)系(R0.999),并且精密度、準(zhǔn)確度、加樣回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均符合要求。并且運(yùn)用此方法,同時(shí)檢測(cè)了梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位中三種環(huán)烯醚萜苷成分的含量。二、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在大鼠血漿中分析方法的建立與確證本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定正常大鼠和不同時(shí)間異黃酮暴露大鼠口服梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后血漿中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物含量的LC-MS/MS法。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證,其專屬性、線性關(guān)系、精確度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等均符合要求。大鼠血漿采用固相萃取法進(jìn)行前處理,以芍藥苷作為內(nèi)標(biāo)物。色譜分析條件為Waters T3柱(150 mm×4.6 mm,3μm),流動(dòng)相為0.06%乙酸水(A)-0.06%乙酸乙腈(B),梯度洗脫,流速為0.6 ml/min,分析時(shí)間為19 min;電噴霧離子源,正離子(京尼平龍膽雙糖苷)和負(fù)離子(山梔苷、梔子苷、京尼平和IS)切換模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),樣品符合線性關(guān)系(R0.99),日內(nèi)和日間精密度(RSD)均小于12.2%,準(zhǔn)確度(RE)在-10.1%~16.4%之間,基質(zhì)效應(yīng)在81.2~89.2%范圍內(nèi),固相萃取提取回收率均大于53.8%。所以該方法可以用于大鼠血漿中環(huán)烯醚萜苷藥代動(dòng)力學(xué)研究的測(cè)定。三、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在正常SD大鼠的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究利用如上建立的LC-MS/MS定性定量分析方法測(cè)定了正常大鼠單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后體內(nèi)山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和京尼平的血藥濃度,計(jì)算四種物質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(C_(max)、t_(1/2)、T_(max)、MRT、AUC_(0→t)和AUC_(0→∞)),繪制四種物質(zhì)的藥時(shí)曲線圖,評(píng)價(jià)正常大鼠體內(nèi)梔子中環(huán)烯醚萜苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為。四、梔子中三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間的異黃酮暴露大鼠的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)將正常SD大鼠平均分為4組,分別口服異黃酮提取物7天、14天、21天和28天后,單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后,利用所建立的LC-MS/MS定性定量分析方法測(cè)定了4組經(jīng)異黃酮暴露大鼠單次口服給藥梔子環(huán)烯醚萜苷有效部位提取物后體內(nèi)山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷和京尼平的血藥濃度,計(jì)算四種物質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(C_(max)、t_(1/2)、T_(max)、MRT、AUC_(0→t)和AUC_(0→∞)),繪制四種物質(zhì)的藥時(shí)曲線圖,評(píng)價(jià)不同時(shí)間異黃酮處理大鼠體內(nèi)梔子中環(huán)烯醚萜苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為。五、異黃酮對(duì)梔子中環(huán)烯醚萜苷藥代動(dòng)力特征影響的研究通過(guò)比較正常大鼠和不同異黃酮暴露時(shí)間的大鼠發(fā)現(xiàn),隨著異黃酮在大鼠體內(nèi)暴露的時(shí)間增加,山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷及其代謝產(chǎn)物京尼平的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)也在逐漸改變,并且其Ⅱ相代謝物京尼平硫酸鹽結(jié)合物也在在逐漸改變。這就提示,隨著異黃酮暴露時(shí)間的增加,腸道菌群可能發(fā)生變化,同時(shí)腸道菌調(diào)控的代謝酶活性可能也在發(fā)生變化。所以,當(dāng)臨床上共同服用異黃酮和環(huán)烯醚萜苷時(shí),不僅需要考慮藥物之間的相互作用,還需要考慮藥物對(duì)腸道菌介導(dǎo)的代謝的影響。
【圖文】：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混和對(duì)照品溶液，分別逐級(jí)稀釋，按照“2.2”、“2.3”項(xiàng)下條件，進(jìn)樣 2 μl，記錄各對(duì)照品的濃度。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X，ng/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，山梔苷：Y= 243.810X-289.957，r=0.9999，線性范圍 10.76～215.2 ng/ml；京尼平龍膽雙糖苷：Y= 137.125X+2092.76，r=0.9996，線性范圍 516～4128 ng/ml；梔子苷：Y= 2030.32X+823213，r=0.9998，線性范圍 2000～20000 ng/ml。以上結(jié)果表明，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)表 1-1。質(zhì)荷比 (m/z)圖 1-2 三種待測(cè)物的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖（A. 山梔苷；B. 京尼平龍膽雙糖苷；C. 梔子苷）Fig 1-2 Product ion mass spectra of the analytes（A. shanzhiside；B. gentiobioside；3. geniposi

過(guò) LC-MS/MS 技術(shù)，，建立一種對(duì)大鼠血漿中梔子三種環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物的定性定量分析方法，利用固相萃取法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理，并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，分別對(duì)專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率以及穩(wěn)定性進(jìn)行考察，以此為梔子中三種主要環(huán)烯醚萜苷及其代謝產(chǎn)物藥代動(dòng)力學(xué)研究提供快速、可靠的分析手段。山梔苷 京尼平龍膽雙糖苷
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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