發(fā)布時間：2020-05-22 01:23

【摘要】：目的:研究百秋李醇(patchouli alcohol,PA)對高血壓性腎損害的治療作用并探討其可能的分子機制,為PA新藥研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。方法:取8周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertension rat,SHR)60只,雌雄各半,適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為:SHR組(等容積生理鹽水)、溶劑組(等容積特級出榨橄欖油)、PA高(80 mg·Kg~(-1)·d~(-1))、中(40 mg·Kg~(-1)·d~(-1))、低劑量組(20 mg·Kg~(-1)·d~(-1))、陽性組(卡托普利,2.5 mg·Kg~(-1)·d~(-1)),每組10只,雌雄各半。另設10只雌雄各半的魏凱氏(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠為正常對照組(等容積生理鹽水)。按以上劑量灌胃給藥,連續(xù)8周。觀察給藥前及給藥后每組大鼠一般情況、體重和尾動脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP);末次給藥后,稱量大鼠體重,取腎臟,測量左、右腎濕重,計算腎臟質量指數(shù);腹主動脈取血,分離血漿,采用肌氨酸氧化酶法檢測血漿肌酐(Creatinine,Cr)水平,脲酶法檢測血漿尿素氮(urea nitrogen,BUN)水平,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血漿腎素、血管緊張素(angiotensionⅡ,AngⅡ)、轉化生長因子β_1(transforming growth factorβ_1,TGF-β_1)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)及腎組織腎素、AngⅡ、TGF-β_1、PAI-1水平;HE及Masson染色分別觀察腎臟腎小管損傷及膠原纖維的病理組織學變化;免疫組化法分析腎組織膠原纖維Ⅰ(collagenⅠ,ColⅠ)、膠原纖維(collagenⅢ,ColⅢ)和纖維黏連蛋白(Fibronectin,FN)表達;實時熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測大鼠腎組織α平滑肌激動蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、組織型金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、ras、raf-1、細胞外信號調節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2,ERK_(1/2))表達;Western blot法分別測定腎組織α-SMA、ras、raf-1、ERK_(1/2)、磷酸化ERK_(1/2)(phosphorylation ERK_(1/2),pERK_(1/2))蛋白表達水平。16SrRNA測序平臺檢測腸道菌群豐度、多樣性及組成結構。結果:1 PA對SHR血壓的作用研究與WKY組比較,SHR的一般狀態(tài)表現(xiàn)為精神欠佳、活動減少、體毛欠光澤、大便偏硬、尿量減少;SHR體重增長減慢,尤其是給藥后第2、3、8周體重增長率明顯降低(p0.01);SBP隨著周齡的增加呈波動性上升(p0.01);血漿腎素、AngⅡ、TGF-β_1和PAI-I水平顯著升高(p0.05或p0.01);腎組織腎素、AngⅡ、TGF-β_1和PAI-1水平無明顯改變(p0.05)。給予高、中、低劑量的PA治療后,發(fā)現(xiàn)PA中劑量(40 mg·Kg~(-1))和低劑量組(20 mg·Kg~(-1))大鼠的一般情況明顯改善,而劑量為80 mg·Kg~(-1)的PA能使雄性SHR出現(xiàn)毛發(fā)粗糙,醬油尿,尾巴質硬、油狀物滲出并伴有棕褐色結痂的藥物毒性反應;PA中劑量組體重增長率在給藥后第2周顯著降低(p0.01)而在給藥后3周體重增長率卻明顯增加(p0.01),PA低劑量組體重增長率在給藥后第1和第8周顯著降低(p0.05或p0.01);PA高、中、低劑量組SBP分別在給藥后第6-8周、第7-8周和第8周顯著降低(p0.05或p0.01),且降壓起效時間與其劑量呈明顯的依賴關系,但降壓幅度與其劑量無關;PA各劑量組血漿和腎組織腎素水平顯著降低(p0.05或p0.01);PA高劑量組血漿Ang II水平顯著降低(p0.01);PA高、中劑量組腎組織PAI-I水平顯著降低(p0.01);PA中、低劑量組血漿TGF-β_1(p0.05或p0.01)和PAI-I水平顯著降低(p0.05);PA低劑量組腎組織TGF-β_1水平顯著降低(p0.05)。2 PA對SHR腎纖維化的作用研究與WKY組比較,SHR組左、右腎質量指數(shù)顯著增加(p0.01);血漿Cr、BUN水平明顯升高(p0.05或p0.01);腎組織明顯出現(xiàn)腎小管損傷、腎小球硬化、腎間質纖維化和炎癥細胞浸潤等病理改變,腎小管損傷和腎纖維化指數(shù)明顯增加(p0.01);腎組織ColⅠ、Ⅲ、FN、raf-1蛋白和α-SMA、ERK_(1/2) mRNA表達顯著增加(p0.05或p0.01);腎組織MMP-9、TIMP-1、ras、raf-1 mRNA和α-SMA、ras、ERK_(1/2)和pERK_(1/2)蛋白無明顯改變(p0.05)。給予不同劑量的PA治療8周后,觀察到低劑量PA能顯著降低左腎質量指數(shù)(p0.05);中、低劑量PA顯著降低右腎質量指數(shù)(p0.01);高劑量PA能顯著降低血漿BUN水平(p0.05),同時升高Cr水平(p0.05);各劑量PA明顯減輕腎小管損傷(p0.05或p0.01);中、低劑量PA顯著抑制腎臟的纖維化(p0.01);各劑量PA顯著降低腎組織ColⅠ表達(p0.05或p0.01);中、低劑量PA顯著降低FN(p0.05或p0.01)、α-SMA(p0.05)和raf-1(p0.05或p0.01)蛋白表達;中劑量PA明顯升高腎組織MMP-9 mRNA表達(p0.05)和抑制α-SMA(p0.05)、TIMP-1mRNA表達(p0.05);PA低劑量顯著降低腎組織ras(p0.05)、raf-1(p0.05)、ERK_(1/2) mRNA(p0.05)和Col III(p0.01)、ERK_(1/2)(p0.05)、pERK_(1/2)蛋白表達(p0.05);PA各劑量組對腎組織ras蛋白表達無明顯作用(p0.05)。3 PA對SHR腸道菌群的作用研究與WKY組比較,SHR組大鼠腸道菌群豐度、多樣性有降低的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);在門水平,擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著降低(p0.05),F/B比值顯著增加(p0.05),硬壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)豐度降低,疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度增加,但差異均無統(tǒng)計學意義(p0.05);屬分類的LEfSe分析顯示毛螺菌科(Lachnospiraceae)UCG 005和擬普雷沃菌屬(Alloprevotell)豐度顯著降低(p0.01),糞球菌屬(Coprococcus)和消化鏈球菌屬(Peptoclostridium)豐度顯著增加(p0.01);血漿SCFAs降低,但差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。經(jīng)不同劑量的PA治療后,發(fā)現(xiàn)Chao 1和Faith’s PD指數(shù)在PA高劑量組明顯升高(p0.05);Shannon指數(shù)在PA高、低劑量組明顯升高(p0.05)而在PA中劑量組明顯降低(p0.05);PA高劑量組Bacteroidetes和Proteobacteria豐度明顯增加(p0.05),F/B比值明顯降低(p0.05);PA中劑量組Firmicutes豐度明顯降低(p0.05),同時Verrucomicrobia豐度明顯增加(p0.05);PA高、中劑量組明顯升高Lachnospiraceae UCG 005豐度(p0.05或p0.01)和降低Peptoclostridium豐度(p0.01);PA各劑量組Alloprevotella豐度明顯增加(p0.05或p0.01);PA低劑量組明顯增加Coprococcus豐度(p0.01);PA各劑量組血漿SCFAs水平均不同程度地升高(p0.01或p0.05)。結論:1 PA對SHR大鼠有降血壓和減輕高血壓所致腎損害作用。但高劑量的PA(80 mg·Kg~(-1))在長期運用過程中可導致大鼠出現(xiàn)藥物毒性反應并加重其腎損傷,提示PA在高劑量運用時應慎重。2 PA具有溫和地降血壓作用,其機制可能與抑制RAS,降低TGF-β_1和PAI-1水平有關;3 PA可明顯改善SHR腎纖維化的病理改變,對腎組織有直接的保護作用,其機制除與抑制RAS系統(tǒng)過度激活和TGF-β_1、PAI-1水平增加外,還可能與抑制腎組織MFB的增殖和活化、減少基質蛋白的合成、促進ECM的降解和調控ras/raf-1/ERK_(1/2)信號通路有關;4基于本實驗中PA可引起SHR腎損傷大鼠腸道菌群豐度、多樣性及組成結構的改變,同時又可引起腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs水平的升高,推測PA對高血壓性腎損害的治療作用可能與調節(jié)腸道菌群有關,但詳細機制有待進一步深入研究。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2675221