【摘要】：香菇為擔(dān)子菌綱傘形科真菌,又稱香覃、摧茸、花菇,是全球第二大人工種植的藥食同源菌,其味道鮮美,營養(yǎng)極其豐富,已被視為“菇中之王”。中醫(yī)理論認(rèn)為香菇具有益氣健脾,扶正祛邪,益壽延年的效果(如《本草綱目》記載香菇“性甘、味平、無毒,益氣不饑,治風(fēng)破血,益味助食,理小便不禁”;《醫(yī)林纂要》中記載香菇“可托豆毒”;《本經(jīng)逢原》中記載香菇“大益胃氣”)�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,香菇中含多種藥理活性良好的藥用成分,其中最主要活性成分即為香菇多糖(LNT)。香菇多糖注射劑在臨床已廣泛用于腫瘤的輔助治療,且已證實(shí)有明顯的療效;而香菇多糖口服制劑,如香菇多糖片和香菇多糖膠囊,目前也已開始在臨床用于消化道腫瘤輔助治療和免疫調(diào)節(jié)。作為保健品,香菇多糖口服制劑更是普及至歐美。目前,香菇多糖的各種藥理活性還在被不斷開發(fā)中,比如已經(jīng)證實(shí)其在抗糖尿病、抗疲勞、防輻射、防結(jié)腸炎等方面均有顯著療效。但是,LNT的藥代動(dòng)力學(xué)信息卻鮮有報(bào)道,這嚴(yán)重限制了LNT作為藥品在臨床的進(jìn)一步推廣和安全使用。因此,本課題沿用實(shí)驗(yàn)室前期確定的提取方法上,改進(jìn)純化工藝,從房縣小香菇中提取純化制備LNT;采用核素標(biāo)記和熒光標(biāo)記對LNT的體內(nèi)過程進(jìn)行示蹤,系統(tǒng)研究LNT口服和靜脈給藥后的藥物動(dòng)力學(xué);采用Ussing Chamber和Caco-2細(xì)胞單層模型研究LNT的腸道吸收機(jī)制;采用體外肝微粒體孵育法研究LNT的肝臟代謝降解機(jī)制,旨在系統(tǒng)深入地探明LNT的藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)。第一部分香菇多糖LNT的制備采用水提醇沉法從房縣小香菇中得到香菇粗多糖,經(jīng)H2O2脫色、超濾、中壓制備柱分離、冷凍干燥最終得到水溶性精制LNT。苯酚-硫酸法測定其糖含量為97.8±2.9%;高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和體積排阻色譜法(SEC)測定其分子量段為400-500 kDa;紫外掃描顯示LNT幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)提取純化的LNT純度高,分子量均一性好,適合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二部分香菇多糖LNT的標(biāo)記及其在生物樣本中定性定置檢測方法的建立選用臨床常用核素锝標(biāo)記LNT,由于LNT不能直接螯合核素,故本研究采用螯合劑DTPA連接在LNT上作為中間體(D-LNT),然后螯合核素锝,得到香菇多糖锝標(biāo)記物(99mTc-LNT)。紅外光譜分析顯示,D-LNT與LNT的紅外圖譜進(jìn)行對比,在1734cm-1處有一明顯的吸收峰;元素分析結(jié)果顯示D-LNT中的N含量,由最初的0.05%升至0.57%,表明D-LNT衍生物制備成功。PD-10柱純化過程中的流出曲線結(jié)果顯示,糖含量流出曲線與γ計(jì)數(shù)流出曲線吻合良好;ITLC-SG層析法結(jié)果顯示,Na99mTc04和99mTc-LNT的Rf值分別為0.70和0.09,表明本研究99mTc-LNT合成成功。D-LNT和LNT的HPGPC圖譜的色譜峰其出峰時(shí)間和峰形基本一致,表明標(biāo)記工藝對LNT的分子量大小和分布沒有明顯影響;剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,D-LNT仍保持LNT的三螺旋結(jié)構(gòu)�？疾�99mTc-LNT的穩(wěn)定性,在生物樣品中的檢測下限(即靈敏度)、精密度、特異性和整體回收率。結(jié)果顯示,37℃下,99mTc-LNT在PBS和血清中24h后標(biāo)記率分別為92.25%和91.28%,穩(wěn)定性良好;檢測下限可以達(dá)到4 ng/mL;生物樣品中低、中、高三種濃度99mTc-LNT的24 h精密度RSD分別在6.12%、4.22%和3.66%以內(nèi),精密度良好;靜脈給藥后,Na99mTc04主要分布在胃,而99mTc-LNT主要分布在肝臟和脾臟,表明99mTc-LNT在生物樣品中檢測特異性良好;99mTc-LNT進(jìn)入體內(nèi)后,最終能檢測到的總量大于90%,回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求。旨在建立了一套LNT在生物樣品中定量檢測的方法。采用水溶性熒光素5-DTAF,在pH=9.5的碳酸鹽緩沖液中,分別在25℃和4℃條件下反應(yīng),透析,Sephadex G-50凝膠柱分離純化得到香菇多糖熒光標(biāo)記物(FLNT)。通過紅外光譜分析、元素分析、紫外光譜掃描、熒光光譜掃描以及HPGPC熒光檢測,共同證明FLNT標(biāo)記的成功。同樣HPGPC示差檢測結(jié)果和剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)熒光標(biāo)記工藝對LNT的分子量和空間結(jié)構(gòu)均無明顯影響�？疾焐飿悠烦鞍讞l件和37℃孵育條件對FLNT色譜峰的影響,證實(shí)FLNT在生物樣品中熒光色譜峰的特異性,建立LNT在生物樣品中定性檢測的方法。本部分實(shí)驗(yàn),結(jié)合放射性標(biāo)記和熒光標(biāo)記的優(yōu)勢,建立LNT在生物樣本中定性定量的檢測方法,為LNT體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。第三部分香菇多糖LNT口服給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)在建立99mTc-LNT生物樣品中定量檢測方法的基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)采用99mTc-LNT灌胃給藥,探索LNT 口服給藥后的血藥濃度、組織分布和排泄。結(jié)果表明,LNT口服后有明顯的吸收,且在1h時(shí)達(dá)到最大血藥濃度,在8h時(shí),仍能在血液中明顯檢測到LNT;在各組織中均有一定分布,其中在與口服吸收相關(guān)的胃腸道組織分布最多,其次是肝臟;99mTc-LNT灌胃后主要隨糞便排泄,但是仍然有明顯的一部分隨尿液排泄。第四部分香菇多糖LNT 口服吸收機(jī)制研究第三部分證實(shí)LNT 口服可以吸收,為探索其吸收機(jī)制,本部分采用Ussing Chamber技術(shù)和Caco-2細(xì)胞單層模型證實(shí)LNT的腸道吸收。Ussing Chamber結(jié)果顯示LNT在各腸道吸收明顯,十二指腸,空腸,回腸和結(jié)腸中FLNT的Papp值分別為 1.08×10-6cm/s,1.62×10-6cm/s,4.06×10-6cm/s和0.70×10-6cm/s,回腸是LNT吸收的優(yōu)勢腸段。激光共聚焦觀察Caco-2細(xì)胞對FLNT的攝取,證實(shí)Caco-2細(xì)胞對FLNT的攝取明顯,且在胞質(zhì)中均勻分布。流式細(xì)胞儀半定量分析Caco-2細(xì)胞對FLNT的攝取量,對FLNT的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究。(1)在FLNT的攝取實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)NaN3和低溫環(huán)境(4℃)可以抑制Caco-2細(xì)胞對FLNT的攝取;(2)細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑中 Chloropromazine、Dynasore、Ly294002和Cytochalasin D均能顯著抑制Caco-2細(xì)胞對FLNT的攝取,而Genistein和β-CD對FLNT的攝取沒有影響;(3)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Bafilomycin A1和Thapsigargin顯著抑制Caco-2細(xì)胞對FLNT 的攝取,而Chloroquine、Vinblastine和Monensin對FLNT 的攝取沒有影響。(4)在FLNT的出胞實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)Bafilomycin A1和Vinblastine對FLNT的出胞具有顯著抑制作用,而Chloroquine、Thapsigargin和Monensin對FLNT的出胞運(yùn)動(dòng)沒有影響。采用Transwell小室構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型,通過加入各種內(nèi)吞途徑抑制劑來考察FLNT在上皮細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果顯示,加入Dynasore、Chloropromazine、Ly294002和Cytochalasin D后,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)率分別減少了26.89%、16.83%、22.30%和34.65%。而加入Genistein和β-CD后,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)率沒有明顯變化。該結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測Caco-2細(xì)胞攝取FLNT的結(jié)果基本一致。通過本部分研究結(jié)果證實(shí),FLNT可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和巨胞飲途徑內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,從而進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),這可能是LNT 口服吸收的機(jī)制之一。第五部分香菇多糖LNT靜脈給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)研究在99mTc-LNT生物樣品中定量檢測方法的基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)合SPECT/CT活體成像,系統(tǒng)研究LNT靜脈給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)特征。血藥濃度結(jié)果顯示,99mTc-LNT經(jīng)靜脈給藥后,在體內(nèi)呈雙相消除,且在0.5-8 mg/kg劑量范圍內(nèi),LNT的劑量對其靜脈給藥后的藥物動(dòng)力學(xué)特征沒有影響。體內(nèi)分布結(jié)果表明,99mTc-LNT經(jīng)靜脈給藥后,迅速在肝臟聚集,其次是脾臟。排泄結(jié)果顯示,99mTc-LNT經(jīng)靜脈給藥后,主要經(jīng)腎隨尿液排泄,但是糞便排泄也占有一定的比例。SPECT/CT成像結(jié)果證實(shí),99mTc-LNT信號最強(qiáng)的部位為肝臟,至4h時(shí)γ信號依然很強(qiáng)。SPECT動(dòng)態(tài)顯像直觀呈現(xiàn)99mTc-LNT靜脈給藥后機(jī)體1 h內(nèi)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化,其變化趨勢與前面血藥濃度、體內(nèi)分布和排泄的研究結(jié)果一致。第六部分香菇多糖LNT肝臟降解代謝的機(jī)制研究采用肝微粒體孵育法研究LNT肝臟代謝降解機(jī)制。在FLNT生物樣品中定性檢測方法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化FLNT與肝微粒體孵育的最佳條件。以H2/H1(降解峰強(qiáng)度/原形峰強(qiáng)度)比值作為降解參數(shù),來判斷FLNT的降解程度。分別以α-萘黃酮、奎尼丁、酮康唑、磺胺甲惡唑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、毛果蕓香堿為CYP 1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP2A6的特異性抑制劑,丙戊酰胺為環(huán)氧化物水解酶抑制劑,探索CYP酶系不同亞型和環(huán)氧化物水解酶對LNT降解的影響。結(jié)果顯示,CYP2D和CYP2C兩種亞型,以及環(huán)氧化物水解酶參與了肝臟LNT的代謝降解。
【圖文】：

用 2-3 個(gè)柱體積流動(dòng)相（子香菇多糖，充分溶解于 0.1 M NaNO。待上樣完畢，樣品全部進(jìn)入填料后，將下端連接示差折光檢測器。NO3溶液為流動(dòng)相，流速為 1.0 mL/min示差折光檢測器的流出曲線圖，合并分制香菇多糖，命名 LNT。粗多糖粉末呈棕黃色，水溶性良好，，不同續(xù)分離純化。

圖 1-2 脫色后香菇多糖Fig. 1-2 Decolorization of crude polysaccharide圖 1-3 超濾液糖含量變化圖ig. 1-3 The picture of ultra-filtrate sugar content cha
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2675014