發(fā)布時(shí)間：2020-05-21 22:28

【摘要】：目的:1.觀察杜仲葉和梔子提取物對(duì)谷氨酸鈉誘導(dǎo)的(MSG)肥胖小鼠自噬調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的影響;2.通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)分析杜仲葉和梔子提取物對(duì)MSG肥胖小鼠膽汁酸相關(guān)組分的影響;3.研究杜仲葉和梔子提取物中有效成分西紅花苷和綠原酸對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞自噬的影響,探討藥物的作用機(jī)制。方法:1.乳鼠出生1d后,皮下注射谷氨酸鈉(4 g/kg/d),每天1次,共7d,正常對(duì)照組乳鼠皮下注射相應(yīng)劑量的生理鹽水(10μl/g/d)。4周后將實(shí)驗(yàn)小鼠分為9組:正常對(duì)照組(Normal)、模型組(Model)、陽(yáng)性對(duì)照藥白藜蘆醇組(100mg/kg,RES)、杜仲葉提取物高劑量組(400 mg/kg,EEH)、杜仲葉低劑量組(100mg/kg,EEL)、梔子提取物高劑量組(400 mg/kg,GEH)、梔子提取物低劑量組(100 mg/kg,GEL)、聯(lián)用高劑量組(400 mg/kg+400 mg/kg,EEH+GEH)、聯(lián)用低劑量組(100 mg/kg+100 mg/kg,EEL+GEL),每組10只。各組小鼠按上述劑量,分別灌胃給藥8周后,處死。采用油紅O染色法觀察小鼠肝臟和附睪脂肪的脂質(zhì)沉積情況;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)和免疫蛋白印記(Western Blot)方法分別檢測(cè)各組小鼠肝臟和附睪脂肪自噬和炎癥相關(guān)基因和自噬蛋白的表達(dá)變化。2.收集MSG小鼠膽汁經(jīng)乙腈沉淀蛋白后,采用SEG protecol C18 ENDURO色譜柱(250 mm×4.6 mm×5μm),流動(dòng)相為4 mmol/l乙酸銨溶液-含0.05%甲酸和乙腈,梯度洗脫,流速1ml/min,進(jìn)樣10μl,電噴霧離子源(ESI)、負(fù)離子的多級(jí)反應(yīng)模式(MRM)監(jiān)測(cè),LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定小鼠膽汁酸各組分的濃度。3.10μM油酸誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞24h建立脂質(zhì)積聚模型,使用西紅花苷(10μM),綠原酸(30μM)及其聯(lián)合(10μM+30μM)干預(yù)細(xì)胞24 h后,Western Blot分析細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)Beclin 1,LC3-II/I,p62,FXR,CREB蛋白的表達(dá);Mitotracker-LC3B共染色免疫熒光法觀察細(xì)胞線粒體自噬。結(jié)果:1.油紅O染色顯示,與模型組相比,各給藥組小鼠的肝臟及附睪脂肪細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯減少,細(xì)胞邊界清晰,EEL+GEL、EEH+GEH和RES作用效果最明顯。2.QPCR結(jié)果顯示,與模型組相比,各給藥組不同程度上調(diào)肝臟中自噬相關(guān)基因ULK1、LC3-I、LC3-II、Atg5、Atg7、Beclin-1和Lamp2a的表達(dá)量(p0.05);而在附睪脂肪中,則不同程度的下調(diào)了這些自噬因子的基因表達(dá),其中以EEH+GEH組的藥效更佳。與此同時(shí)各給藥組還不同程度的抑制促炎癥因子TGFα、COL1α、MMP13、RELMα和增加抗炎因子MGL-1、CD206、IL-10的表達(dá)水平。3.Western Blot結(jié)果顯示,與模型組相比,各給藥組明顯上調(diào)肝臟中RAB7、Beclin1、Atg5、CREB、CRTC2、PPARα、TFEB、PGC1α、AMPK、ULK1和LC3II/I的蛋白表達(dá)(p0.05),同時(shí)顯著性下調(diào)P62、FXR和P-m TOR蛋白的表達(dá)量(p0.05);而顯著降低了附睪脂肪中RAB7、Beclin-1、Atg5、CREB、CRTC2、PPARα、TFEB、PGC1α、AMPK、ULK1和LC3II/I的蛋白表達(dá)(p0.05),升高了P62、FXR和Pm TOR的表達(dá)量(p0.05),其中均以EEH+GEH組的作用更佳。4.LC-MS/MS結(jié)果顯示,與模型組相比各給藥組明顯下調(diào)肥胖小鼠膽汁中DCA、GDCA、GUDCA的含量(p0.05),同時(shí)明顯上調(diào)CDCA、UDCA、GCA、GCDCA的含量(p0.05),對(duì)LCA和TUDCA的含量影響不大。5.免疫熒光結(jié)果顯示,與正常組相比,油酸誘導(dǎo)后Hep G2細(xì)胞中線粒體自噬下降明顯,而藥物(CRO,CGA,CRO+CGA)干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬明顯增加,其中CRO和CGA聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬增加最為明顯;Western Blot結(jié)果顯示,各給藥組不同程度增加Beclin1、CREB和LC3II/I的蛋白表達(dá)(p0.05)同時(shí)明顯降低FXR和P62的表達(dá)量(p0.05)。結(jié)論:綜上所述,MSG肥胖小鼠肝臟和脂肪組織自噬基因水平均顯著增加,肝臟自噬相關(guān)蛋白水平下降而脂肪自噬相關(guān)蛋白水平增加。各給藥組不同程度改善了MSG肥胖小鼠肝和脂肪組織的自噬水平,并具有明顯的抗炎作用;初步闡明了MSG肥胖小鼠膽汁酸亞組分含量的變化及各組藥物調(diào)節(jié)肥胖小鼠膽汁酸含量的特征;體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)杜仲葉和梔子提取物的主要組分CRO+CGA聯(lián)合給藥能顯著增加Hep G2細(xì)胞中線粒體的自噬功能,初步揭示了杜仲葉和梔子提取物減肥調(diào)脂的自噬相關(guān)機(jī)制。
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 杜仲葉和梔子提取物的減肥調(diào)脂藥效結(jié)果驗(yàn)證3.3.1對(duì)肥胖小鼠體重增長(zhǎng)差值、Lee's 指數(shù)、附睪脂肪濕重影響給藥 8w 后，與正常組比較，模型組出現(xiàn)明顯的中心性肥胖體征 (p<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠體重增長(zhǎng)差值、Lee's 指數(shù)、附睪脂肪重量均顯著下降。杜仲葉和梔子高劑量聯(lián)用組（EEH+GEH）減重效果最明顯(p<0.05)。本部分的具體結(jié)果數(shù)值未顯示，請(qǐng)參見課題組前期相應(yīng)結(jié)果[12]。3.3.2油紅染色觀察肥胖小鼠肝臟、脂肪組織變化如圖 1.1 所示，油紅 O 染色顯示 Normal 組小鼠的肝細(xì)胞邊界清楚，胞質(zhì)內(nèi)可見極少量橘紅色脂滴，Model 組小鼠的肝臟組織染色顯示肝細(xì)胞體積變大，橘紅色脂滴增加，空泡化。各給藥組與模型組相比較肝細(xì)胞邊界變清晰，橘紅色脂滴減少，空泡化減少，其中以 EEL+GEL、EEH+GEH 和 RES組效果最明顯。

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 賴玲林如圖 1.2 所示，油紅 O 染色顯示 Normal 組小鼠的脂肪細(xì)胞邊界清楚，胞質(zhì)內(nèi)可見少量橘紅色脂滴，Model 組小鼠的脂肪組織染色顯示脂肪細(xì)胞體積變大，橘紅色脂滴巨大，成片出現(xiàn)。各給藥組與模型組相比較不同程度的脂肪細(xì)胞邊界清晰，，橘紅色脂滴減少，其中以 EEL+GEL、EEH+GEH 和 RES組效果最明顯。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2675002