【摘要】：Rho激酶(ROCKs)是小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白RhoA的主要效應(yīng)分子,其在血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中均有一定表達,ROCK分別有ROCK1和ROCK2兩種亞型,它們在氨基酸序列和激酶結(jié)構(gòu)域上具有一定的同源性,ROCK在動脈粥樣硬化、心力衰竭、肺動脈高壓、血管重塑等心血管疾病中具有一定的生理作用。靜息狀態(tài)下,RhoA位于胞質(zhì)中,活化后可轉(zhuǎn)移到胞膜上,并活化下游的ROCK,使肌球蛋白輕鏈脫磷酸化酶(MLCP)的肌球蛋白結(jié)合亞基(MBS)磷酸化,導(dǎo)致MLCP失活,磷酸化的肌球蛋白輕鏈(MLC)不能脫磷酸,并且ROCK也可使MLC直接磷酸化,使平滑肌收縮性增強,最終使冠狀動脈發(fā)生痙攣反應(yīng),從而引發(fā)一系列的心血管疾病,Rho激酶抑制劑Y27632可通過舒張血管來改善血管痙攣的產(chǎn)生。映山紅花總黃酮(total flavones of rhododendra,TFR)是從映山紅花中提取的有效部位,蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等是其主要成分。我們以前報道TFR有血管舒張作用,其機制涉及到血管中RhoA活性降低。但有關(guān)TFR是否通過阻斷Rho激酶而對血管產(chǎn)生舒張效應(yīng),從而改善血管痙攣仍有待進一步探討。本研究通過siRNA體內(nèi)干擾技術(shù),下調(diào)了大鼠體內(nèi)ROCK1、ROCK2蛋白表達,觀察了TFR對血管舒張作用的變化,并探討其作用與阻斷ROCK及與ROCK亞型的關(guān)系。目的:1.觀察大鼠血管舒張作用的Rho激酶阻斷機制。2.探討TFR對大鼠血管的舒張作用與ROCK及與ROCK亞型的關(guān)系。方法:1.采用siRNA體內(nèi)干擾技術(shù),建立轉(zhuǎn)染模型。1.1.分別取冠狀動脈、腸系膜動脈、腸系膜靜脈、腹主動脈,每種血管各分為5組,分別為:(1)空白對照組(control);(2)陰性siRNA干擾組(negative);(3)轉(zhuǎn)染試劑組(transfection reagent);(4)ROCK_1-siRNA干擾組(ROCK_1-siRNA group);(5)ROCK_2-siRNA干擾組(ROCK_2-siRNA group)。1.2 western blot方法測定血管組織中ROCK_1和ROCK_2蛋白的表達。2.建立血管張力實驗,分別使用TFR和Y27632來檢測其對正常大鼠和ROCK_1-siRNA、ROCK_2-siRNA轉(zhuǎn)染的血管的舒張作用。2.1實驗分組:分別取冠狀動脈、腸系膜動脈、腸系膜靜脈、腹主動脈,每種血管各分為:溶媒(vehicle)組、TFR組、ROCK_1-siRNA+vehicle組、ROCK_1-siRNA+TFR組、ROCK_2-siRNA+vehicle組、ROCK_2-siRNA+TFR組、Y27632組、ROCK_1-siRNA+Y27632組、ROCK_2-siRNA+Y27632組。結(jié)果:1.與對照組相比,ROCK_1-siRNA轉(zhuǎn)染組的ROCK1蛋白表達和ROCK_2-siRNA轉(zhuǎn)染組的ROCK2蛋白表達明顯降低,而且,與對照組相比,各血管組織中的轉(zhuǎn)染試劑組及陰性siRNA組ROCK_1和ROCK_2蛋白的表達并未明顯降低。2.與溶媒組(ROCK_1-siRNA+vehicle)相比,Y27632可誘導(dǎo)ROCK1下調(diào)的大鼠冠狀動脈、腸系膜動脈、腸系膜靜脈、腹主動脈產(chǎn)生舒張效應(yīng),而與正常大鼠血管相比,Y27632對ROCK_1-siRNA干擾的血管的舒張效應(yīng)明顯減弱。3.與溶媒組(ROCK_2-siRNA+vehicle)相比,Y27632可誘導(dǎo)ROCK2下調(diào)的大鼠冠狀動脈、腸系膜動脈、腹主動脈產(chǎn)生舒張效應(yīng),而對腸系膜靜脈舒張作用不明顯。與正常大鼠血管作用相比,Y27632對ROCK_2-siRNA干擾的血管的舒張作用降低。4.與溶媒組(ROCK_1-siRNA+vehicle)相比,TFR可誘導(dǎo)ROCK1下調(diào)的大鼠冠狀動脈、腸系膜動脈、腸系膜靜脈和腹主動脈產(chǎn)生舒張效應(yīng),與正常大鼠血管相比,TFR對ROCK_1-siRNA轉(zhuǎn)染的血管的舒張效應(yīng)明顯減弱。5.與溶媒組(ROCK_2-siRNA+vehicle)相比,TFR可引起ROCK2下調(diào)的大鼠冠狀動脈、腸系膜動脈和腹主動脈產(chǎn)生舒張效應(yīng),而對ROCK2下調(diào)的腸系膜靜脈并未產(chǎn)生明顯的舒張作用。且與未經(jīng)過ROCK2轉(zhuǎn)染的大鼠血管相比,TFR可明顯減弱ROCK_2-siRNA轉(zhuǎn)染的血管的舒張作用。6.Y27632對各血管的舒張作用與阻斷ROCK有關(guān),且對腸系膜靜脈的舒張作用與ROCK2阻斷有關(guān),對腸系膜動脈的舒張作用與ROCK1關(guān)系更密切。7.TFR對各血管的舒張作用與阻斷ROCK有關(guān),且對腸系膜動脈、腸系膜靜脈、腹主動脈的舒張作用選擇性作用于ROCK2,而對冠狀動脈的舒張效應(yīng)與ROCK1關(guān)系更為密切。結(jié)論:1 ROCK1、ROCK2下調(diào)可減弱Y27632和TFR的血管舒張作用。2 TFR對大鼠血管的舒張作用可能與阻斷ROCK有關(guān),并對冠狀動脈的舒張作用與阻斷ROCK1有關(guān),而對腸系膜動脈、腸系膜靜脈、腹主動脈的舒張作用可能與ROCK2的關(guān)系更為密切。
【圖文】：

圖 1. ROCK1-siRNA 和 ROCK2-siRNA 轉(zhuǎn)染對大鼠冠狀動脈中 ROCK1和 ROCK2蛋白表達影響（means ± SD, n =3)。Fig 1. The effects of ROCK1-siRNA and ROCK2-siRNA transfection in vivo on the expression of R-OCK1and ROCK2protein in rat coronary artery (means ± SD, n =3).注：A: ROCK1蛋白表達結(jié)果；B: ROCK1蛋白定量分析；C: ROCK2蛋白表達結(jié)果；D：ROCK2蛋白定量分析。與對照組相比，，**P < 0.01。Note: A: Representative of ROCK1protein expression; B: Quantification of ROCK1protein expressi-on; C: Representative of ROCK2protein expression; D: Quantification of ROCK2protein expression.**P < 0.01 vs. the control group.AC

圖 1. ROCK1-siRNA 和 ROCK2-siRNA 轉(zhuǎn)染對大鼠冠狀動脈中 ROCK1和 ROCK2蛋白表達影響（means ± SD, n =3)。Fig 1. The effects of ROCK1-siRNA and ROCK2-siRNA transfection in vivo on the expression of R-OCK1and ROCK2protein in rat coronary artery (means ± SD, n =3).注：A: ROCK1蛋白表達結(jié)果；B: ROCK1蛋白定量分析；C: ROCK2蛋白表達結(jié)果；D：ROCK2蛋白定量分析。與對照組相比，**P < 0.01。Note: A: Representative of ROCK1protein expression; B: Quantification of ROCK1protein expressi-on; C: Representative of ROCK2protein expression; D: Quantification of ROCK2protein expression.**P < 0.01 vs. the control group.ABCD
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 張梅;潘大仁;;杜鵑屬植物黃酮類化合物的研究進展[J];海峽科學(xué);2012年05期

本文編號：2674918