【摘要】：結(jié)直腸癌(CRC)是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一,2012年世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球每年約有130多萬(wàn)的結(jié)直腸癌新發(fā)病例,在所有的惡性腫瘤發(fā)病率中位居第三位。其死亡率約50%,位居惡性腫瘤死亡率的第四位。近年來(lái),我們研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢(shì)。雖然我國(guó)在全球結(jié)直腸癌分布圖中處于低發(fā)區(qū)域,但隨著生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變,我們結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。截止2015年,我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)已超過(guò)37.6萬(wàn),死亡病例19.1萬(wàn)以上。目前,手術(shù)和化療仍是治療結(jié)直腸癌的一種有效方法,但它的副作用極大,導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。因此,尋找高效、低毒,防治結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的藥物是目前結(jié)直腸癌治療中迫切需要解決的問(wèn)題。白三烯A4水解酶(LTA4H)是白三烯B4的關(guān)鍵酶,具有氨肽酶和環(huán)氧化物水解酶的雙重活性。白三烯B4是許多炎癥反應(yīng)。近期有關(guān)觀察到,LTA4H在一些惡性腫瘤的組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。LTA4H的氨肽酶可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),影響腫瘤細(xì)胞的活性。AKT又稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),它是分子量大約為60KD的蛋白,在磷脂酰肌醇-3(羥基)激酶(PI3K)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用。AKT在細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝、存活等一系列細(xì)胞活動(dòng)中起著重要作用,此外AKT還充當(dāng)抗凋亡信號(hào)激酶的作用。AKT可分為3種亞型(AKT1、AKT2、AKT3),3種亞型的功能各異。其中,AKT1主要參與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移;AKT2參與胰島素功能的調(diào)節(jié);而AKT3則是主要表達(dá)在腦組織內(nèi)。中成藥及其有效成分預(yù)防和治療腫瘤的作用與化學(xué)藥物相比有很多優(yōu)勢(shì)。有研究證明中藥抗腫瘤的作用機(jī)制主要表現(xiàn)為:(1)調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期(2)阻滯腫瘤細(xì)胞增殖(4)調(diào)控基因表達(dá)(5)抵抗基因突變(6)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(7)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移(8)免疫調(diào)節(jié)。姜是姜科姜屬,多年生草本植物姜的根莖,是常用的中藥材,是藥食兩用植物。藥用部分為新鮮根狀莖,具有祛寒、祛濕、暖胃、加速血液循環(huán)等多種保健功能,是臨床治療惡心、嘔吐、眩暈、腹痛、胃炎的常用中藥。其主要的成分是姜酚。姜酚包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚、甲基-6-姜酚等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)姜酚的分子結(jié)構(gòu)、藥理作用進(jìn)行了大量研究,姜酚具有強(qiáng)心、保肝利膽、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、止痛等藥理作用。在本研究中,我們利用美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Hormel研究院由老姜根中提純的姜提取物(Ginger extract)進(jìn)行研究,其主要成分包括6-Gingerol、8-Gingerol、10-Gingerol和6-Shogaol。我們發(fā)現(xiàn)姜提取物可以LTA4H和AKT通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)顯示姜提取物可以同時(shí)和LTA4H和AKT競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合在疏水性的ATP“口袋”從而發(fā)揮抑制作用。并且下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中LTA4H和AKT的基因,可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和錨定非依賴性生長(zhǎng)。第一章姜提取物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖及錨定非依賴生長(zhǎng)方法1.自主研發(fā)合成姜提取物。2.細(xì)胞毒性試驗(yàn):檢測(cè)姜提取物對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(HCEC)的毒性。3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn):研究生姜提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞不依賴貼壁生長(zhǎng)的影響。4.MTS法:檢測(cè)姜提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響。結(jié)果1.由老姜中提取出來(lái),能夠同時(shí)抑制LTA4H和AKT激酶活性的化合物姜提取物2.姜提取物對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCEC無(wú)明顯的毒性作用MTS結(jié)果顯示:正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(HCEC)在不同濃度梯度的姜提取物加藥24h或者48h后,與0μg/ml姜提取物相比較,492nm處吸光度無(wú)明顯降低,提示姜提取物對(duì)HCEC無(wú)明顯毒性。3.姜提取物可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示:隨著姜提取物濃度的增加,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和HCT15的克隆形成起到抑制作用。姜提取物濃度為20μg/ml時(shí)可以顯著抑制了DLD1和HCT15克隆的形成(p0.01),50%以上的克隆被抑制。姜提取物濃度達(dá)到40μg/ml時(shí)克隆完全被抑制。4.姜提取物能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著姜提取物濃度的增加,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和HCT15的細(xì)胞活性能夠明顯抑制。當(dāng)濃度達(dá)到40μg/ml時(shí),加藥72h后,DLD1和HCT15的492nm處吸光度顯著降低(p0.01)。第二章姜提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的周期方法1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的調(diào)控。3.不同濃度的姜提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞,Western blot檢測(cè)其對(duì)凋亡信號(hào)的影響。4.不同濃度的姜提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞,Western blot檢測(cè)其對(duì)周期信號(hào)的影響。結(jié)果1.姜提取物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度的姜提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞72小時(shí)后,0μg/ml姜提取物僅能誘導(dǎo)8.5%的細(xì)胞凋亡。而用40μg/ml姜提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT15 72小時(shí)后,結(jié)果顯示能夠誘導(dǎo)83.68%的細(xì)胞凋亡,差異顯著(p0.01)。2.姜提取物調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度的姜提取物處理結(jié)腸癌細(xì)胞72小時(shí)后,姜提取物0μg/ml使細(xì)胞阻滯在S期。而隨著姜提取物濃度的逐漸增加至40μg/ml處理結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT15 72小時(shí)后,細(xì)胞周期阻滯在G1期。3.姜提取物具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡功能,并且使凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生改變Western blot檢測(cè)結(jié)果:姜提取物在不同濃度處理結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和HCT15細(xì)胞72h后,P53,cleaved-PARP,cleaved caspase 3、Bax等促凋亡相關(guān)蛋白上調(diào),P-stat3,P-ERK,PARP,Bcl-2等抗細(xì)胞凋亡蛋白下調(diào)。4.姜提取物能夠調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的周期,并且引起細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)的改變Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,姜提取物在不同濃度處理結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和HCT15細(xì)胞72小時(shí)后,G1相關(guān)周期蛋白cyclin D1和cyclin E2下調(diào)。第三章LTA4H和AKT在人結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)方法1.Western blot檢測(cè)LTA4H和AKT在不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和HCT15中的表達(dá)情況,并且以正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCEC作為對(duì)照。2.在人結(jié)腸癌組織中通過(guò)免疫組化法檢測(cè)LTA4H和AKT的表達(dá)情況。3.結(jié)腸癌細(xì)胞在姜提取物處理72h后,用Western blot檢測(cè)其對(duì)LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平的影響。結(jié)果1.與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞相比,LTA4H和AKT在結(jié)腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)Western blot結(jié)果顯示:與正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞HCEC相比,LTA4H和AKT在不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。2.LTA4H和AKT相對(duì)于結(jié)腸癌癌旁正常組織,在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)免疫組化結(jié)果顯示:LTA4H和AKT相對(duì)于結(jié)腸癌癌旁正常組織,在人結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài),且差異性顯著(p0.01)。3.姜提取物可以抑制LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平,呈濃度依賴性姜提取物以不同濃度處理結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT15 72小時(shí)后,Western blot檢測(cè)LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平。結(jié)果顯示:姜提取物能夠抑制BLT1和P-stat3的磷酸化水平,并且呈現(xiàn)劑量依賴的方式。第四章姜提取物在體外結(jié)合并抑制LTA4H和AKT的活性方法1.利用超級(jí)計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬化合物姜提取物與靶標(biāo)蛋白LTA4H和AKT的相互作用。2.利用蛋白下拉實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜提取物與LTA4H和AKT在細(xì)胞水平的相互作用。結(jié)果1.姜提取物與LTA4H或者AKT蛋白的ATP結(jié)合區(qū)域相結(jié)合超級(jí)計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)證明:姜提取物與LTA4H和AKT的ATP結(jié)合口袋存在相互作用,能與這一結(jié)構(gòu)結(jié)合形成復(fù)合物。2.姜提取物與LTA4H和AKT蛋白在細(xì)胞水平結(jié)合Pull down實(shí)驗(yàn)證明:姜提取物能與LTA4H和AKT相互作用,形成復(fù)合物。第五章下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1的克隆形成和細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期。方法1.利用針對(duì)LTA4H和AKT的sh RNA,包裝出逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1,從而下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)。DLD1細(xì)胞被Western Blot檢測(cè)不同的sh RNA對(duì)LTA4H和AKT下調(diào)的效果,以β-actin作為上樣對(duì)照。2.軟瓊脂集落下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1克隆形成的影響。3.MTS檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1增殖能力產(chǎn)生的影響。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1的凋亡產(chǎn)生影響。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1細(xì)胞周期的影響。6.Western Blot檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá),對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1產(chǎn)生凋亡相關(guān)蛋白,同時(shí)能夠使LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3磷酸化水平的影響。7.Western Blot檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1周期相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果1.用sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分別包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒成功調(diào)低結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1中的LTA4H和AKT表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示:用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分別包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染DLD1細(xì)胞系,LTA4H和AKT的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯下降,以β-actin作為上樣對(duì)照。2.sh RNA#1(sh LTA4H#1+shAKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+shAKT1#793)的DLD1細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯少于shmock DLD1細(xì)胞組數(shù)目。軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:調(diào)低LTA4H和AKT的表達(dá)后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1的非依賴性生長(zhǎng),跟shmock細(xì)胞組相比,克隆數(shù)目明顯減少(p0.01)。3.調(diào)低LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力MTS結(jié)果顯示:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組能夠顯著抑制結(jié)腸癌DLD1的增殖(p0.01)。4.調(diào)低LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠顯著促使結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組能夠引起DLD1細(xì)胞系18%和10%的細(xì)胞凋亡,從而促使sh Mock的細(xì)胞凋亡只有1%(p0.01)。5下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠顯著調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的存活周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)處理結(jié)腸癌細(xì)胞DLD172小時(shí)后,細(xì)胞阻滯在G1期。而sh Mock處理過(guò)的細(xì)胞阻滯在S期。6.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,加速P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,能明顯抑制LTA4H下游信號(hào)分子BLT1和AKT下游信號(hào)分子P-stat3的磷酸化水平Western Blot結(jié)果:與sh Mock細(xì)胞組相比,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組分別在DLD1細(xì)胞系中明顯加速了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、BAX等促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。同時(shí),下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平后,明顯抑制了LTA4H下游信號(hào)分子BLT1和AKT下游信號(hào)分子P-stat3的磷酸化水平。7.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,引起細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)的改變Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組處理結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1細(xì)胞72小時(shí)后,下調(diào)G1相關(guān)周期蛋白cyclin D1和cyclin E2。第六章下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15的克隆形成和細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期。方法1.利用針對(duì)LTA4H和AKT的shRNA,分離出逆轉(zhuǎn)錄病毒,促使感染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15,進(jìn)一步影響下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)不同的sh RNA對(duì)LTA4H和AKT調(diào)低的效果,以β-actin作為上樣對(duì)照。2.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15克隆形成的影響。3.MTS檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,能夠?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞HCT15增殖能力的影響。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,能夠?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞HCT15凋亡的影響。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15周期的影響。6.Western Blot檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15凋亡相關(guān)蛋白以及LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3磷酸化水平的影響。7.Western Blot檢測(cè)下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15周期相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果1.用sh RNA#1(sh LTA4H#1+shAKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分別包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒成功調(diào)低結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15中的LTA4H和AKT表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示:用sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分別包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HCT15細(xì)胞系,LTA4H和AKT的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯下降,以β-actin作為上樣對(duì)照。2.sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)的HCT15細(xì)胞組克隆形成數(shù)明顯少于shmock HCT15細(xì)胞組軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15的錨定非依賴性生長(zhǎng),跟shmock細(xì)胞組相比,克隆數(shù)目明顯減少(p0.01)。3.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力MTS結(jié)果顯示:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)后,shRNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組能夠顯著抑制結(jié)腸癌HCT15的增殖(p0.01)。4.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠顯著加速結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15的凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平后,;sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組分別能夠引起HCT15細(xì)胞系9%和12%的細(xì)胞凋亡,而引起sh Mock的細(xì)胞凋亡只有2%(p0.01)。5.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,能夠明顯調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組處理結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT15 72小時(shí)后,細(xì)胞阻滯在G1期。而sh Mock處理過(guò)的細(xì)胞阻滯在S期。6.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,明顯增加了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)顯著抑制了LTA4H下游信號(hào)分子BLT1和AKT下游信號(hào)蛋白P-stat3的磷酸化水平Western Blot結(jié)果顯示:與sh Mock細(xì)胞組相比,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組分別HCT15細(xì)胞系中明顯增加了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、BAX等促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)調(diào)低LTA4H和HCT15的表達(dá)水平后,顯著抑制了LTA4H下游信號(hào)分子BLT1和AKT下游信號(hào)分子P-stat3的磷酸化水平。7.下調(diào)LTA4H和AKT的表達(dá)水平,引起細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)的改變Western blot檢測(cè)結(jié)果:sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)細(xì)胞組處理結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT15細(xì)胞72小時(shí)后,下調(diào)G1相關(guān)周期蛋白cyclin D1和cyclin E2。結(jié)論1.姜提取物作為本實(shí)驗(yàn)室提取的一種混合物,通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬、體外水平及細(xì)胞水平的研究結(jié)果證實(shí):姜提取物直接作用于LTA4H和AKT的ATP結(jié)合區(qū)域上,與LTA4H和AKT結(jié)合,通過(guò)ATP競(jìng)爭(zhēng)抑制的方式使結(jié)合區(qū)域失活,從而達(dá)到抑制其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,起到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的作用。2.從分子水平與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看到,兩者結(jié)論相一致。姜提取物能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,且無(wú)明顯毒副作用。這為結(jié)腸癌的分子靶向治療提供了新的治療選擇。
【圖文】：

圖 1-1 姜提取物化學(xué)結(jié)構(gòu)式ig. 1-1 Chemical structure of Ginger Extr結(jié)腸上皮細(xì)胞 HCEC 沒(méi)有毒提取物對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 HCESO 作為對(duì)照。結(jié)果顯示：姜提取對(duì)照組相比，其增殖效率差異不顯g/ml 或者低于 40μg/ml 時(shí)對(duì) HCEC

圖 1-2 MTS 檢測(cè)姜提取物對(duì) HCEC 的細(xì)胞毒性。以 DMSO 作為對(duì)照組，不同濃度的姜提取物加藥 HCEC 細(xì)胞 24 小時(shí)或者 48 小時(shí)。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Fig. 1-2 MTS detects the cytotoxicity of ginger extract on HCEC. DMSO was used as a controlgroup, and different concentrations of ginger extract were added to HCEC cells for 24 hours or 48hours. Statistical data were expressed using mean ± standard deviation.2.3 姜提取物能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)通過(guò)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，我們來(lái)檢測(cè)姜提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞 DLD1 和HCT15 的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明：姜提取物能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞 DLD1 和HCT15 的克隆形成，且呈濃度依賴性（圖 1-3）。相對(duì)于對(duì)照組（ DMSO），，當(dāng)姜提取物 20μg/ml 時(shí)，可以顯著抑制 DLD1 和 HCT15 克隆形成（p<0.01），姜提取物 40μg/ml 時(shí)，可以使 DLD1 和 HCT15 克隆完全消失（p<0.01）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 王佳蕾;李進(jìn);秦叔逵;程穎;張清媛;劉天舒;楊春康;葉正寶;徐農(nóng);鄭磊貞;胡春宏;張沂平;陶敏;于志堅(jiān);莊志祥;;雷替曲塞或氟尿嘧啶/亞葉酸鈣聯(lián)合奧沙利鉑治療局部晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的隨機(jī)對(duì)照多中心Ⅲ期臨床試驗(yàn)[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2012年01期

本文編號(hào)：2674502