【摘要】：目的:毛蕊異黃酮(Calycosin)是我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分之一,具有明顯的植物雌激素(Phytoestrogens)特點。其在抗病毒以及對人類惡性腫瘤增殖的抑制作用方面表現(xiàn)出一定的藥理學效應,近些年尤其在抗心腦血管疾病方面的作用也受到廣泛關(guān)注。據(jù)報道,雌激素(Estrogen,E2)可以提供神經(jīng)保護作用,在腦缺血/再灌注損傷(Ischemia and Reperfusion Injury,I/R)的動物模型中,攝入一定的植物雌激素可降低腦損傷程度。新的證據(jù)表明自噬(Autophagy)在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中起著重要作用。p62(也稱為sequestosome-1/SQSTM1)是一個選擇性自噬底物和多領(lǐng)域的支架蛋白。與p62相似,NBR1(neighbor of BRCA1 gene1)還可以調(diào)節(jié)泛素化降解。最近的研究表明,凋亡、炎癥與自噬之間存在著復雜的關(guān)聯(lián)。在本課題組之前的實驗研究結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮對大腦局灶性缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用,但具體機制尚未明確。在本研究中,我們構(gòu)建大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的體內(nèi)模型,從分子、形態(tài)學及動物水平探討毛蕊異黃酮在腦缺血再灌注損傷中對腦神經(jīng)元的作用機制以及與相關(guān)自噬、凋亡和炎癥因子的影響。方法:(1)建立成年雄性SD大鼠大腦中動脈阻塞模型,在動物體內(nèi)模擬腦缺血再灌注損傷過程。(2)在MCAO模型建立后,2小時局部缺血,再灌注24小時,隨機分為空白對照組(sham-operated group)、缺血/再灌注模型組(I/R group)、低濃度藥物組(calycosin-treated 5mg/kg+MCAO)、中濃度藥物組(calycosin-treated 10mg/kg+MCAO)和高濃度藥物組(calycosin-treated 20mg/kg+MCAO),分別觀察大鼠的神經(jīng)行為評分(Neurological scores)、腦梗死體積(Infarct volumes)、腦組織含水量(Brain water content)的影響。通過動物實驗上的對比,驗證毛蕊異黃酮在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。(3)采用蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR及免疫組織化學技術(shù)的方法,進一步檢測大鼠大腦組織中的自噬相關(guān)蛋白p62和NBR1、凋亡因子Bcl-2以及炎癥因子TNF-α表達水平。結(jié)果:經(jīng)過預處理14天,毛蕊異黃酮顯著減輕了缺血再灌注腦組織的損傷,明顯改善了局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能,減少了腦梗死體積和腦水腫。我們觀察到腦缺血再灌注后,通過Western Blot、RT-PCR和免疫組化實驗,p62、NBR1和Bcl-2蛋白的表達顯著降低,而TNF-α水平明顯增加。而且,在MCAO模型腦組織中,隨著毛蕊異黃酮藥物濃度的增加,p62、NBR1和Bcl-2表達顯著上調(diào),且下調(diào)了TNF-α水平,其與毛蕊異黃酮劑量大小呈相關(guān)性。結(jié)論:我們的研究表明,植物雌激素毛蕊異黃酮通過影響大鼠大腦組織中的自噬相關(guān)蛋白p62、NBR1、凋亡因子Bcl-2以及炎癥因子TNF-α水平,對大鼠缺血再灌注損傷發(fā)揮著神經(jīng)保護作用,機制可能與其抗自噬,抗凋亡,抗炎癥的功能作用有關(guān)。這些結(jié)果為腦卒中的治療提供了新的思路。
【圖文】：

對比 I/ R 組，10-20mg /kg 毛蕊異黃酮藥物組明顯降低了梗死體積和腦水腫率。這些結(jié)果表明，毛蕊異黃酮可以減輕腦缺血再灌注損傷。圖1 毛蕊異黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能的影響。圖1A是毛蕊異黃酮化學分子結(jié)構(gòu)。

圖 2 毛蕊異黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷中 p62 表達水平的影響。圖 2A是 RT-PCR 法檢測 p62的 mRNA 表達水平。圖 2B 是免疫印跡法檢測 p62 的蛋白表達水平。圖 2C 是免疫組化染色檢測 p62的平均光密度值。結(jié)果表示為平均數(shù)±標準誤。△△P＜0.01，I/R 組與空白對照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，，毛蕊異黃酮藥物組與 I/R 組比較，n =3。Fig. 2. Effects of calycosin on expression levels of p62 in cerebral ischemia and reperfusion rats.Tissue from the penumbra was collected at 24 h after reperfusion and used for Quantitative real RT-PCRand western blot analysis. Sections obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded brain tissuespecimens were used for immunohistochemical analyses. (A) Calycosin increased p62 mRNA expressionlevels in I/R rats. (B) Top panel and bottom panel are representative bands and p62 relative protein levels.Calycosin increased p62 protein expression levels in I/R rats. (C) Representative p62immunohistochemically stained sections and semiquantitative density results. Calycosin treatment
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2674076