【摘要】：背景:肺癌目前是我國乃至全球死亡率最高的惡性腫瘤,近年來發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是腫瘤血管生成的另一途徑,與肺癌的不良預后密切相關。乏氧是誘導VM形成的一個重要始動因素,而腫瘤干細胞通過多種途徑參與VM形成。前期研究發(fā)現(xiàn)川芎和丹參可抑制肺癌類干細胞樣細胞(cancer stem-like cells,CSLCs)VEGF、HIF-1α以及EMT相關蛋白的表達,這些蛋白與VM形成機制相關。由此,我們推測川芎和丹參可能抑制肺癌CSLCs VM的形成,且在不同的氧環(huán)境下作用機制不同。目的:首先分離富集A549 CSLCs亞群,并對其干細胞特性進行鑒定;然后觀察A549 CSLCs促VM形成的作用;最后明確川芎和丹參單藥組和兩藥配伍組分別對不同氧環(huán)境下肺癌CSLCs VM形成的抑制作用及具體分子機制,旨在觀察單味藥及配伍后的作用效果,為中藥的臨床實踐提供實驗基礎。方法:(1)采用無血清成球培養(yǎng)法分選A549 CSLCs亞群,并通過單細胞克隆形成實驗和小鼠移植瘤形成實驗檢測細胞增殖能力、劃痕實驗檢測細胞遷移能力以及流式細胞術(shù)檢測腫瘤干細胞表面標志物,共同鑒定所分選的球細胞為CSLCs。(2)通過Matrigel小管形成實驗檢測A549 CSLCs三維小管形成能力,免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞標志蛋白CD31、vWF觀察A549CSLCs向內(nèi)皮細胞誘導轉(zhuǎn)化能力,從而判斷A549CSLCs促VM形成的作用。(3)建立A549 CSLCs荷瘤小鼠模型,分為常氧組和乏氧組,每組進一步分為對照組、川芎組、丹參組、川芎和丹參(川丹)組以及恩度組,通過激光共聚焦檢測各組vWF蛋白表達,CD31/PAS雙染法檢測各組VM形成,觀察川芎和丹參對不同氧環(huán)境下A549CSLCs VM的作用。(4)ELISA法檢測VEGF的表達,RT-PCR法檢測VEGF、MMP-9的mRNA表達,Western Blot法檢測各組MACC1、HGF、c-MET、TWIST、VE-Cadherin、FAK、EphA2、Integrin β1、HIF-1α蛋白的表達,分析川芎和丹參對不同氧環(huán)境下A549CSLCs VM作用的具體機制。結(jié)果:(1)無血清培養(yǎng)的A549細胞于第3天開始形成形態(tài)較規(guī)則的細胞球,隨后細胞球逐漸增大,到第5天細胞球的折光性開始降低,連續(xù)傳代2次,球體更加立體規(guī)整。單細胞克隆形成實驗提示A549球細胞形成的單個克隆灶的細胞數(shù)目明顯多于其親代細胞,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.05)。小鼠移植瘤形成實驗發(fā)現(xiàn)A549球細胞較原代A549細胞更早成瘤,在30天觀察時間結(jié)束時,5×105數(shù)量級A549球細胞的成瘤率為100%,原代細胞的成瘤率為80%;1×105數(shù)量級A549球細胞的成瘤率為100%,原代細胞的成瘤率為60%;1×104數(shù)量級A549球細胞的成瘤率為100%,原代細胞的成瘤率為0,說明A549球細胞較原代細胞更易成瘤。劃痕實驗結(jié)果顯示,分別在第6h、12h和24h A549球細胞均比其原代細胞有更強的細胞遷移能力(P0.01)。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),A549球細胞表面干細胞標志物CD44+/CD24-/low的表達量高達80.4%。(2)觀察EA.hy926、A549原代細胞、常氧A549CSLCs和乏氧A549CSLCs在三維培養(yǎng)體系中小管形成的能力。結(jié)果顯示,與A549原代細胞相比,A549 CSLCs具有較強的小管形成能力,且在乏氧環(huán)境下更明顯,小管形態(tài)更接近EA.hy926形成的小管。免疫熒光檢測結(jié)果顯示,與常氧環(huán)境比較,A549CSLCs在乏氧環(huán)境下CD31、vWF的表達明顯增加,表明在乏氧環(huán)境下A549CSLCs向內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化的能力更明顯。(3)激光共聚焦檢測結(jié)果顯示,常氧環(huán)境下,與對照組相比,丹參組和川丹組可促進vWF蛋白表達,其余各組均無明顯差異;乏氧環(huán)境下,與對照組相比,各組之間對vWF蛋白表達無明顯差異;不同氧環(huán)境比較結(jié)果,與常氧組相比,各組之間對vWF蛋白表達也無明顯差異。CD31/PAS雙染法結(jié)果顯示,無論常氧環(huán)境還是乏氧環(huán)境,川芎組、丹參組、川丹組和恩度組均可抑制VM的形成;不同氧環(huán)境比較,各組之間無明顯差異。(4)ELISA法結(jié)果顯示,常氧環(huán)境下,與對照組相比,川芎組、丹參組、川丹組和恩度組均明顯抑制VEGF的表達(P均0.01);乏氧環(huán)境下,各組之間對VEGF的表達無明顯差異;不同氧環(huán)境比較結(jié)果,與常氧組相比,乏氧環(huán)境下各組均明顯促進VEGF的表達(P均0.01),這可能與乏氧本身作為信號促進VEGF的表達有關。RT-PCR法檢測VEGF的結(jié)果顯示,常氧環(huán)境下,川芎組、丹參組、川丹組和恩度組均能明顯抑制VEGF的表達(P均0.01);乏氧環(huán)境下,各組之間對VEGF的表達無明顯差異;不同氧環(huán)境比較結(jié)果,與常氧組相比,乏氧環(huán)境下各組VEGF表達普遍增高,這可能與乏氧本身作為信號促進VEGF的表達有關。RT-PCR法檢測MMP-9的結(jié)果顯示,常氧環(huán)境下,川芎組、丹參組、川丹組和恩度組均能明顯抑制MMP-9的表達(P均0.01);乏氧環(huán)境下,各組之間無明顯差異;不同氧環(huán)境比較結(jié)果,與常氧組相比,乏氧環(huán)境下各組MMP-9表達普遍增高,這可能與乏氧本身作為信號促進MMP-9的表達有關。Western Blot法檢測結(jié)果顯示,常氧環(huán)境下,川芎組、川丹組和恩度組可抑制MACC1的表達,丹參組可抑制HGF的表達,丹參組可抑制c-MET的表達,丹參組和恩度組可抑制TWIST的表達,丹參組、川丹組可抑制VE-Cadherin的表達,丹參組可抑制FAK的表達,川芎組和丹參組可抑制EphA2的表達,丹參組可抑制Integrinβ1的表達;乏氧環(huán)境下,川芎組可抑制MACC1的表達,丹參組可抑制HGF的表達,川芎組可抑制c-MET的表達,丹參組可抑制TWIST的表達,丹參組可抑制VE-Cadherin的表達;川芎組、丹參組和恩度組可抑制FAK的表達,川芎組和恩度組可抑制EphA2的表達,川芎組和川丹組可抑制Integrin β1的表達。結(jié)論:(1)無血清培養(yǎng)法分離富集的球細胞具有干細胞樣細胞的干性。(2)A549CSLCs較A549細胞有更強的促VM形成能力,且在乏氧環(huán)境下促VM形成能力更強。(3)常氧和乏氧環(huán)境下川芎、丹參以及兩者配伍均能抑制VM的形成,然而,無論常氧還是乏氧環(huán)境,川芎和丹參配伍對抑制VM的形成協(xié)同作用不明顯。(4)川芎、丹參以及兩者配伍在不同氧環(huán)境下對VM的抑制作用機制不完全相同。
【圖文】：

因此，進一步探討調(diào)節(jié)ＶＭ的關鍵分子機制將成為癌癥治療的重要方向。逡逑３邋ＶＭ通過多種途徑促進癌癥的復發(fā)轉(zhuǎn)移逡逑ＶＭ通過調(diào)控多種分子信號通路促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移（如圖１）。研究已經(jīng)發(fā)逡逑現(xiàn)與ＶＭ相關的主要分子包括血管內(nèi)皮粘素（ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，逡逑ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）［２３’２４］，上皮細胞激酶（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｋｉｎａｓｅ，，ＥｐｈＡ２）邋ｔ２５１，粘附斑激酶（ｆｏｃａｌ逡逑ａｄｈｅｓｉｏｎ邋ｋｉｎａｓｅ，ＦＡＫ）丨２６］，基質(zhì)金屬蛋白酶（ｍａｔｒｉｘ邋ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰｓ）丨２７］，逡逑血管內(nèi)皮生長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）【２８】等。逡逑ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ不僅可以促進血管內(nèi)皮細胞連接、維持血管內(nèi)皮屏障功能，而且能調(diào)逡逑節(jié)鄰近血管的生成［２９］。ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ僅由高度侵襲性的腫瘤細胞表達，在侵襲性較差的逡逑腫瘤細胞中檢測不到，這說明存在血管生成轉(zhuǎn)換的可能性。而ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表達的下調(diào)逡逑消除了惡性腫瘤細胞形成血管網(wǎng)絡的能力

圖２腫瘤干細胞與ＶＭ的關系逡逑綜上所述，ＣＳＣｓ既能直接或者通過轉(zhuǎn)向分化為血管平滑肌樣細胞參與ＶＭ形成，逡逑又能通過ＥＭＴ或分泌一些細胞因子促進ＶＭ形成（如圖２所示）。然而，ＣＳＣｓ與ＶＭ逡逑之間的相互作尚有諸多問題亟待解決，如ＣＳＣｓ在腫瘤血管生成和ＶＭ形成的相同和不逡逑同的作用機制；靶向ＣＳＣｓ治療后是否可以完全阻斷ＶＭ的發(fā)生等。隨著研宄的不斷深逡逑入，ＣＳＣｓ在ＶＭ形成過程中的具體機制必將進一步明確，可望在腫瘤臨床治療方面取逡逑得突破性的進展。逡逑參考文獻逡逑［１］邐Ｗｕ邋Ｓ，邋Ｙｕ邋Ｌ，邋Ｃｈｅｎｇ邋Ｚ，邋ｅｔ邋ａｌ．邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍａｓｐｉｎ邋ｉｎ邋ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ邋ｃｅｌｌ邋ｌｕｎｇ邋ｃａｎｃｅｒ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ逡逑ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｔｏ邋ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ邋ｍｉｍｉｃｒｙ邋［Ｊ］＿邋Ｊ邋Ｈｕａｚｈｏｎｇ邋Ｕｎｉｖ邋Ｓｃｉ邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ邋Ｍｅｄ邋Ｓｃｉ，邋２０１２，邋３２逡逑（３）：邋３４６－３５２．逡逑［２］邐Ｒｏｕｄｓａｒｉ邋ＬＣ，邋Ｗｅｓｔ邋ＪＬ．邋Ｓｔｕｄｙｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｉｎ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｍｏｄｅｌ逡逑ｓｙｓｔｅｍｓ邋［Ｊ］．邋Ａｄｖａｎｃｅｄ邋ｄｒｕｇ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋ｒｅｖｉｅｗｓ，邋２０１６，邋９７：邋２５０－２５９．逡逑［３］邐Ｈａｌｌ邋ＲＤ
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2673800