【摘要】：聽(tīng)力功能障礙是由于各種原因引起雙耳不同程度損傷而達(dá)不到正常功能水平的感覺(jué)功能障礙。若其不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行良好的干預(yù)將嚴(yán)重影響患者的言語(yǔ)、認(rèn)知及情感的發(fā)育,進(jìn)而影響其身心健康和生活質(zhì)量,同時(shí)也會(huì)加重社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。氨基糖苷類(lèi)抗生素是用于靶向革蘭陰性菌的一類(lèi)重要的抗感染劑,作為一類(lèi)廣譜抗菌且無(wú)明顯過(guò)敏性的抗生素在臨床一直備受青睞,但其應(yīng)用卻因巨大的耳毒性和腎毒性而受到很大限制。即便如此,在治療多耐藥性菌群感染時(shí),慶大霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素發(fā)揮著極其重要的作用。由于其價(jià)廉易得、抗菌譜廣等特點(diǎn),臨床應(yīng)用也相對(duì)廣泛,引發(fā)的聽(tīng)力障礙在治療人群占有較高的比例。同時(shí),臨床上尚無(wú)療效良好的治療耳聾藥物。因此,建立一種藥源性耳聾模型,進(jìn)一步尋找抗耳聾藥物達(dá)到克服其毒性而不影響其藥效的方法,并進(jìn)一步闡明耳聾機(jī)制和藥物抗耳聾機(jī)制顯得尤為重要。以往比較常見(jiàn)的藥物耳毒性評(píng)級(jí)機(jī)制是建立在藥物對(duì)豚鼠或者大鼠的內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷基礎(chǔ)之上的。由于這兩種模式動(dòng)物在對(duì)藥物的毒性安全進(jìn)行考察時(shí)會(huì)存在較大局限性,斑馬魚(yú)作為新型模式動(dòng)物也逐漸吸引了越來(lái)越多的科研工作者。許多傳統(tǒng)中藥及相關(guān)方劑被證明對(duì)耳聾具有一定的療效,而對(duì)具體到某一種中藥的抗耳聾活性組分卻是知之甚少。此外,藥用植物內(nèi)生真菌素以代謝產(chǎn)物豐富、活性多樣化而成為近年天然藥物研究的熱點(diǎn)之一,但其用于抗耳毒性活性成分篩選的研究甚少。因此,本研究以慶大霉素為模型藥物,旨在建立一種穩(wěn)定的藥源性斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷模型,通過(guò)對(duì)多種中藥材粗提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三相萃取物和水相,以及從兩株華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18發(fā)酵液中分離純化的部分次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選,快速尋找具有抗耳毒活性組分。主要研究?jī)?nèi)容包括:(1)利用已知具有明確耳毒性的慶大霉素建立藥源性斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷模型,并將一側(cè)斑馬魚(yú)神經(jīng)丘(SO1、SO2、O1、OC1)毛細(xì)胞形態(tài)及其數(shù)量的變化作為檢測(cè)指標(biāo)。將斑馬魚(yú)分別置于100、50、25及10μmol/L慶大霉素溶液中孵育8、6和4 h發(fā)現(xiàn),10μmol/L慶大霉素中孵育6 h可以使毛細(xì)胞損傷程度達(dá)到一半,建立達(dá)到類(lèi)似IC50效果的毛細(xì)胞損傷模型。同時(shí)通過(guò)不同濃度(0.5%、0.2%)DMSO作用不同時(shí)間(6、4及2 h)發(fā)現(xiàn),DMSO對(duì)斑馬魚(yú)具有一定的損傷作用;0.2%DMSO對(duì)斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷很小,可作為合適的藥物助溶劑。(2)利用所建立的模型,首次將具有抗耳毒性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)和依達(dá)拉奉單獨(dú)作為陽(yáng)性藥物,揭示出該藥源性斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷模型的穩(wěn)定性,以及后期用于大規(guī)模篩選時(shí)的可行性。研究發(fā)現(xiàn),200μmol/L NAC對(duì)慶大霉素介導(dǎo)的斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷具有拮抗作用;250μmol/L依達(dá)拉奉也對(duì)其具有保護(hù)作用。(3)多種中藥提取物中抗耳毒活性組分的篩選。利用已建立的斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷模型研究不同濃度(20、100和500μg/mL)香附、蟬蛻、地龍、苦杏仁、郁金、薄荷、紅花、菊花、黃芩、黃芪、梔子及白芍這12味中藥萃取物(石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相),篩選出了具有抗耳毒性的活性組分,包括香附乙酸乙酯相、蟬蛻正丁醇相、苦杏仁正丁醇相、郁金乙酸乙酯相、薄荷正丁醇相及地龍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相,以便后期對(duì)其抗耳聾機(jī)制進(jìn)行研究。(4)將華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵,從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離了CYC6-1,CYC6-2,CYC6-3及CYC18-1四個(gè)化合物并解析出結(jié)構(gòu),后期進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)CYC6-2和CYC6-3具有較弱的抗耳毒活性。
【圖文】：

的孵化及保存豐年蝦卵置于冰箱冷凍室進(jìn)行保存。本實(shí)驗(yàn)采喂前兩天，將約一管豐年蝦（10 mL）置于 500（約 7g）的自來(lái)水（450 mL）加入塑料瓶?jī)?nèi)，化出的豐年蝦。再將上層未孵化的死蝦及殘余蝦受精卵的收集與孵化實(shí)驗(yàn)室繁殖有配對(duì)產(chǎn)卵和人工授精兩種方法，大，故本實(shí)驗(yàn)斑馬魚(yú)受精卵采用配對(duì)繁殖方法魚(yú)加大飼料量進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化。具體操作[91]如下于繁殖盒底部，插好隔板，再將處理過(guò)的自來(lái)例 2:3 置于繁殖盒內(nèi)，雌魚(yú)和雄魚(yú)通過(guò)隔板分予充分光照并讓其相互追逐，可見(jiàn)雄魚(yú)與雌魚(yú)時(shí)完成排卵受精過(guò)程。每半小時(shí)收集一次，收

圖 2-2 斑馬魚(yú)神經(jīng)丘毛細(xì)胞（A：DASPEI 染色；B：示意圖[92]）Figure 2-2 The hair cell of Neuromast fluorescence from zebrafishA: DASPEI staining; B: Schematic diagram[92]解 DMSO 對(duì)斑馬魚(yú)的作用，結(jié)合參考文獻(xiàn)[93,94]設(shè)計(jì)具體實(shí)驗(yàn)步驟5 dpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)按3尾/孔置于96孔板中，并分別置于濃度為0 中孵育 6、4、2 小時(shí)，孵育結(jié)束后幼魚(yú)用胚胎液潤(rùn)洗 3 次，再加005%的 DASPEI 進(jìn)行染色，15 min 后用空白培養(yǎng)液潤(rùn)洗 3 次，再mL 的 MS222（200 μL）進(jìn)行麻醉，5 min 后結(jié)束麻醉并用空白胚。玻片上滴加幾滴 3%甲基纖維素，再用滴管將麻醉后的斑馬魚(yú)滴用紙巾輕輕擦拭玻片周?chē)�，并吸去滴管帶入的水使魚(yú)固定于甲基顯微鏡（藍(lán)光激發(fā)）調(diào)整觀(guān)察體位，以便于對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察過(guò)程中注意避光，并盡量減少觀(guān)察時(shí)間以防熒光淬滅。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2672439