【摘要】：聽力功能障礙是由于各種原因引起雙耳不同程度損傷而達不到正常功能水平的感覺功能障礙。若其不能被及時發(fā)現(xiàn)并進行良好的干預將嚴重影響患者的言語、認知及情感的發(fā)育,進而影響其身心健康和生活質(zhì)量,同時也會加重社會經(jīng)濟負擔。氨基糖苷類抗生素是用于靶向革蘭陰性菌的一類重要的抗感染劑,作為一類廣譜抗菌且無明顯過敏性的抗生素在臨床一直備受青睞,但其應用卻因巨大的耳毒性和腎毒性而受到很大限制。即便如此,在治療多耐藥性菌群感染時,慶大霉素等氨基糖苷類抗生素發(fā)揮著極其重要的作用。由于其價廉易得、抗菌譜廣等特點,臨床應用也相對廣泛,引發(fā)的聽力障礙在治療人群占有較高的比例。同時,臨床上尚無療效良好的治療耳聾藥物。因此,建立一種藥源性耳聾模型,進一步尋找抗耳聾藥物達到克服其毒性而不影響其藥效的方法,并進一步闡明耳聾機制和藥物抗耳聾機制顯得尤為重要。以往比較常見的藥物耳毒性評級機制是建立在藥物對豚鼠或者大鼠的內(nèi)耳毛細胞損傷基礎之上的。由于這兩種模式動物在對藥物的毒性安全進行考察時會存在較大局限性,斑馬魚作為新型模式動物也逐漸吸引了越來越多的科研工作者。許多傳統(tǒng)中藥及相關方劑被證明對耳聾具有一定的療效,而對具體到某一種中藥的抗耳聾活性組分卻是知之甚少。此外,藥用植物內(nèi)生真菌素以代謝產(chǎn)物豐富、活性多樣化而成為近年天然藥物研究的熱點之一,但其用于抗耳毒性活性成分篩選的研究甚少。因此,本研究以慶大霉素為模型藥物,旨在建立一種穩(wěn)定的藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型,通過對多種中藥材粗提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三相萃取物和水相,以及從兩株華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18發(fā)酵液中分離純化的部分次級代謝產(chǎn)物進行篩選,快速尋找具有抗耳毒活性組分。主要研究內(nèi)容包括:(1)利用已知具有明確耳毒性的慶大霉素建立藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型,并將一側斑馬魚神經(jīng)丘(SO1、SO2、O1、OC1)毛細胞形態(tài)及其數(shù)量的變化作為檢測指標。將斑馬魚分別置于100、50、25及10μmol/L慶大霉素溶液中孵育8、6和4 h發(fā)現(xiàn),10μmol/L慶大霉素中孵育6 h可以使毛細胞損傷程度達到一半,建立達到類似IC50效果的毛細胞損傷模型。同時通過不同濃度(0.5%、0.2%)DMSO作用不同時間(6、4及2 h)發(fā)現(xiàn),DMSO對斑馬魚具有一定的損傷作用;0.2%DMSO對斑馬魚毛細胞損傷很小,可作為合適的藥物助溶劑。(2)利用所建立的模型,首次將具有抗耳毒性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)和依達拉奉單獨作為陽性藥物,揭示出該藥源性斑馬魚毛細胞損傷模型的穩(wěn)定性,以及后期用于大規(guī)模篩選時的可行性。研究發(fā)現(xiàn),200μmol/L NAC對慶大霉素介導的斑馬魚毛細胞損傷具有拮抗作用;250μmol/L依達拉奉也對其具有保護作用。(3)多種中藥提取物中抗耳毒活性組分的篩選。利用已建立的斑馬魚毛細胞損傷模型研究不同濃度(20、100和500μg/mL)香附、蟬蛻、地龍、苦杏仁、郁金、薄荷、紅花、菊花、黃芩、黃芪、梔子及白芍這12味中藥萃取物(石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相),篩選出了具有抗耳毒性的活性組分,包括香附乙酸乙酯相、蟬蛻正丁醇相、苦杏仁正丁醇相、郁金乙酸乙酯相、薄荷正丁醇相及地龍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相,以便后期對其抗耳聾機制進行研究。(4)將華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18進行大規(guī)模發(fā)酵,從其次級代謝產(chǎn)物中分離了CYC6-1,CYC6-2,CYC6-3及CYC18-1四個化合物并解析出結構,后期進一步篩選發(fā)現(xiàn)CYC6-2和CYC6-3具有較弱的抗耳毒活性。
【圖文】：

的孵化及保存豐年蝦卵置于冰箱冷凍室進行保存。本實驗采喂前兩天，將約一管豐年蝦（10 mL）置于 500（約 7g）的自來水（450 mL）加入塑料瓶內(nèi)，化出的豐年蝦。再將上層未孵化的死蝦及殘余蝦受精卵的收集與孵化實驗室繁殖有配對產(chǎn)卵和人工授精兩種方法，大，故本實驗斑馬魚受精卵采用配對繁殖方法魚加大飼料量進行營養(yǎng)強化。具體操作[91]如下于繁殖盒底部，插好隔板，再將處理過的自來例 2:3 置于繁殖盒內(nèi)，雌魚和雄魚通過隔板分予充分光照并讓其相互追逐，可見雄魚與雌魚時完成排卵受精過程。每半小時收集一次，收

圖 2-2 斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞（A：DASPEI 染色；B：示意圖[92]）Figure 2-2 The hair cell of Neuromast fluorescence from zebrafishA: DASPEI staining; B: Schematic diagram[92]解 DMSO 對斑馬魚的作用，結合參考文獻[93,94]設計具體實驗步驟5 dpf的斑馬魚幼魚按3尾/孔置于96孔板中，并分別置于濃度為0 中孵育 6、4、2 小時，孵育結束后幼魚用胚胎液潤洗 3 次，再加005%的 DASPEI 進行染色，15 min 后用空白培養(yǎng)液潤洗 3 次，再mL 的 MS222（200 μL）進行麻醉，5 min 后結束麻醉并用空白胚。玻片上滴加幾滴 3%甲基纖維素，再用滴管將麻醉后的斑馬魚滴用紙巾輕輕擦拭玻片周圍，，并吸去滴管帶入的水使魚固定于甲基顯微鏡（藍光激發(fā)）調(diào)整觀察體位，以便于對毛細胞進行形態(tài)學觀察過程中注意避光，并盡量減少觀察時間以防熒光淬滅。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

【參考文獻】

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本文編號：2672439