【摘要】：1 研究目的經(jīng)典名方在中醫(yī)診療體系中一直發(fā)揮著重要作用,源于經(jīng)典名方的中成藥臨床重定位研究,有利于其臨床價(jià)值的發(fā)揮。本文以經(jīng)典名方四逆湯(Sini Decoction,簡(jiǎn)稱SNT)為范例,采用“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)-動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證-蛋白質(zhì)組學(xué)分析”整合研究策略,針對(duì)下利清谷這一主癥,進(jìn)行了其適應(yīng)癥的研究與再評(píng)價(jià),對(duì)SNT干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)的作用進(jìn)行了發(fā)現(xiàn)、藥效評(píng)價(jià)與初步機(jī)制研究,為實(shí)現(xiàn)SNT臨床重定位奠定基礎(chǔ)。2 研究方法和結(jié)果2.1基于生物信息學(xué)的四逆湯作用預(yù)測(cè)通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集SNT組方中藥的化學(xué)成分,并進(jìn)行“成分-靶標(biāo)”的預(yù)測(cè)。經(jīng)GO和KEGG顯著性富集分析SNT潛在藥物靶標(biāo)所涉及的分子、功能和生物途徑,同時(shí)使用OMIM、TTD和DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多源顯著性富集分析SNT潛在作用消化系統(tǒng)疾病。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)收集SNT三味藥共335個(gè)化學(xué)成分,共預(yù)測(cè)得到1009個(gè)相應(yīng)的靶點(diǎn),且化學(xué)成分之間存在共同作用靶標(biāo)。其中,附子與干姜共有靶標(biāo)有143個(gè);附子與甘草之間共有靶標(biāo)有146個(gè);干姜與甘草之間共有靶標(biāo)有396個(gè);三味藥共有靶標(biāo)有110個(gè),提示SNT中三味藥之間存在潛在的配伍理念。通過(guò)功能富集分析發(fā)現(xiàn),SNT特異性作用于肝臟、胃、結(jié)腸和小腸等消化器官。此外,SNT還富集分布于結(jié)直腸癌細(xì)胞、十二指腸、胃癌細(xì)胞、直腸、食管、腸等消化系統(tǒng)。SNT所涉及的臨床疾病富集分析結(jié)果,提示了 SNT作用消化系統(tǒng)疾病可能涉及UC。最后,基于前期古代臨床醫(yī)案挖掘、現(xiàn)代中醫(yī)臨床用藥經(jīng)驗(yàn)分析,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果及疾病出現(xiàn)頻次,同時(shí)兼顧疾病轉(zhuǎn)化規(guī)律和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可行性,通過(guò)整合分析,提示了 SNT下利清谷癥消化系統(tǒng)臨床定位和UC的潛在關(guān)聯(lián)。2.2四逆湯干預(yù)TNBS誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的藥效研究鑒于上述臨床重定位的預(yù)測(cè)結(jié)果,為考察SNT和UC之間的關(guān)聯(lián),選擇2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)法誘導(dǎo)的急性 UC模型進(jìn)行藥效研究和驗(yàn)證。根據(jù)大鼠體重隨機(jī)分為T(mén)NBS誘導(dǎo)組和空白組,其中TNBS誘導(dǎo)組進(jìn)行TNBS造模。對(duì)造模成功的大鼠依照體重和造模嚴(yán)重程度分層隨機(jī)分為模型組、SNT(19.2、9.6、4.8g·kg-1)組和SASP(柳氮磺吡啶腸溶片,Sulfasalazine Enteric-coated Tablets,SASP)組。造模觀察三天后開(kāi)始給藥。SNT組分別按照相應(yīng)劑量灌胃給藥。陽(yáng)性藥SASP組以0.5 g·kg-1劑量灌胃給藥SASP混懸液,其余給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間采用一般觀察和疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)價(jià)UC大鼠狀態(tài)。給藥結(jié)束后,ELISA方法檢測(cè)各組大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2表達(dá)量;Griess法檢測(cè)各組血清中NO含量;結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)(colonmucosa damage index,CMDI)評(píng)價(jià)和HE染色評(píng)價(jià)大鼠結(jié)腸損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),UC大鼠較正常組DAI增加,CMDI顯著升高,血清中TNF-α、PGE2和IL-6水平顯著上升,并具有上調(diào)NO表達(dá)的趨勢(shì),提示造模成功。SNT可明顯改善UC大鼠腹瀉、便血、改善結(jié)腸粘膜充血、水腫、損傷和黏連等癥狀,可顯著下調(diào)血清TNF-α、PGE2、IL-6表達(dá)水平,并具有下調(diào)NO表達(dá)的趨勢(shì)。此外,較陽(yáng)性藥SASP組,SNT各組對(duì)TNF-α、PGE2、IL-6表達(dá)水平的下調(diào)能力更具優(yōu)勢(shì)。初步認(rèn)為SNT19.2、9.6、4.8g·kg-1組均可顯著改善中輕度UC腸粘膜損傷等癥狀,通過(guò)下調(diào)TNF-α、PGE2和IL-6表達(dá)水平發(fā)揮抗UC的藥效,且效應(yīng)優(yōu)于SASP�；诖�,本文從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證了 SNT干預(yù)UC的藥效作用,進(jìn)一步為SNT下利清谷癥消化系統(tǒng)臨床定位與UC間的關(guān)聯(lián)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.3四逆湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制和關(guān)鍵靶標(biāo)研究為進(jìn)一步分析SNT干預(yù)UC作用機(jī)制,在SNT藥效作用基礎(chǔ)之上,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析空白組、模型組和SNT組(9.6g·kg-1)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸蛋白表達(dá)情況,經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后進(jìn)行差異蛋白篩選,以及GO和KEGG功能富集分析,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研篩選潛在關(guān)鍵蛋白并驗(yàn)證。經(jīng)分析,篩選出78個(gè)SNT調(diào)節(jié)UC的關(guān)鍵差異蛋白,包括26個(gè)上調(diào)蛋白和52個(gè)下調(diào)蛋白,闡釋了 SNT對(duì)UC的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用。結(jié)合生物信息學(xué)分析,初步認(rèn)為SNT可能通過(guò)作用內(nèi)膜、胞外區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔等部位的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮干預(yù)作用。SNT調(diào)節(jié)的蛋白參與了糖胺聚糖結(jié)合、硫化合物結(jié)合、鈣離子結(jié)合、TLR4結(jié)合、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、胞吐作用、細(xì)胞外基質(zhì)組織、中性粒細(xì)胞脫顆粒、細(xì)胞分泌等過(guò)程。共篩選出 CRP、MPO、CAMP、S100A9、S100A8、SPARC、COL12A1 和 ELANE 等16個(gè)關(guān)鍵蛋白。將CRP和COL12A1作為潛在的待篩選的靶標(biāo),其中CRP是臨床已知的UC生物標(biāo)志物。并通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn),確證了 SNT對(duì)臨床常用生物標(biāo)志物CRP的下調(diào)作用,驗(yàn)證了 SNT對(duì)新的潛在關(guān)鍵靶標(biāo)COL12A1的下調(diào)作用。提示SNT可能通過(guò)降低結(jié)腸和血清CRP和COL12A1的蛋內(nèi)表達(dá)發(fā)揮干預(yù)UC作用,以及COL12A1具有作為新的潛在關(guān)鍵靶標(biāo)價(jià)值。綜上,本文進(jìn)一步確證了 SNT下利清谷癥與UC的關(guān)聯(lián)性,初步闡明了 SNT干預(yù)UC藥效作用機(jī)制。3 結(jié)論本研究利用整合策略,初步將SNT主治證下利清谷新定位為消化系統(tǒng)疾病UC,并觀察了其治療效果,發(fā)現(xiàn)SNT可改善糞便粘稠度、抑制便血等癥狀,修復(fù)中輕度UC大鼠結(jié)腸粘膜損傷,下調(diào)血清TNF-α、PGE2、和IL-6表達(dá)水平,且效應(yīng)優(yōu)于SASP。此外,SNT還通過(guò)調(diào)節(jié)78個(gè)UC的關(guān)鍵差異蛋白發(fā)揮干預(yù)UC的藥效作用,其中CRP和COL12A1可作為SNT干預(yù)UC的潛在關(guān)鍵靶標(biāo)。該整合研究策略,對(duì)SNT進(jìn)行了臨床重定位,并對(duì)經(jīng)典名方的二次開(kāi)發(fā)提供了有效的示范。
【圖文】：
圖１－１四逆湯各藥間共有靶標(biāo)分析（ＧＡＮＣＡＯ：甘草；ＧＡＮＪＩＡＮＧ：千姜；ＦＵ逡逑ＺＩ：附子）逡逑
圖１－２四逆湯潛在靶點(diǎn)的組織特異分布逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
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