【摘要】：糖尿病屬于內(nèi)分泌失調(diào)的代謝性疾病,主要伴隨著糖耐量低、尿糖陽性以及持續(xù)高血糖癥狀等病理特征。目前,糖尿病主要分類為:I型糖尿病和II型糖尿病,其中II型糖尿病(T2DM)患者在所有糖尿病患者中所占比例高達90%以上,因此T2DM引起了國內(nèi)外的廣泛關注。胰島素抵抗(IR)是導致T2DM的主要原因之一,而IR是由氧化應激通過多途徑、多靶點作用于胰島素信號傳導通路所導致。以氧化應激信號通路為靶向途徑,研發(fā)改善IR的藥物對開發(fā)糖尿病新藥具有重要意義。因此,本文在前期研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草中活性組分黃酮(FC)和三萜(TC)具有抗氧化活性的基礎上,將深入探討FC和TC組分通過抗氧化途徑達到緩解IR效果的具體機制,明確仙鶴草中的活性組分改善IR所涉及的具體途徑以及信號通路,為開發(fā)仙鶴草活性組分作為抗糖尿病新藥奠定基礎。本文主要研究內(nèi)容和結果如下:(1)通過高糖誘導人肝癌HepG2細胞建立穩(wěn)定的體外IR模型。(1)采用含各濃度高糖培養(yǎng)液干預細胞,觀察葡萄糖攝取情況。結果表明55 mM的干預組細胞對2-NBDG攝取熒光值(0.49)是所有高糖干預組中最低的,約為正常對照組的二分之一。在糖消耗實驗中,干預后12h內(nèi),高糖(55 mM)干預組與正常對照組糖消耗量分別為1.65和4.12 mM,二者存在極顯著差異。干預后24h內(nèi),二者糖耗量分別為6.38、3.5 mM,仍存在顯著性差異�？纱_定建模最優(yōu)條件為高糖(55 mM)培養(yǎng)液干預24h,且該模型在24h內(nèi)可保持穩(wěn)定的IR狀態(tài)。(2)細胞中ROS水平測定結果表明,高糖(55 mM)干預組平均熒光值顯著高于其余各組。可知IR模型中的ROS含量顯著升高,表明胰島素抵抗人肝癌細胞(IR-HepG2)中氧化應激水平升高。(2)研究了仙鶴草活性組分FC和TC對IR-HepG2細胞糖代謝的影響。(1)當FC和TC濃度為2.5μg/mL時,通過歸一化法計算出FC和TC組平均攝取熒光值分別0.84和0.75,與模型組(0.51)相比較,二者的平均攝取熒光值分別提高了33%和24%,有顯著性差異(p0.05),表明二者均能改善IR細胞對2-NBDG的攝取情況。(2)FC和TC濃度為2.5μg/mL時,其糖耗量分別為5.69和5.17 mM,此時正常對照組和模型組糖耗量分別為6.43和3.45mM。與模型組比較,FC和TC組的糖耗量顯著升高。上述結果表明當FC和TC在一定濃度下可顯著改善IR細胞中的糖代謝情況。(3)應用生物化學法和q-PCR技術研究了仙鶴草活性組分FC和TC對IR-HepG2細胞氧化應激的影響。(1)IR模型細胞中ROS含量隨著FC、TC濃度的升高而逐漸降低。當FC和TC組分的干預濃度為2.5μg/m L時,評估ROS含量的平均熒光值分別為80403.3、107841.6,正常對照組和模型組分別為76767.1、142026.8,此時與模型組比較,FC和TC干預組細胞中ROS含量顯著降低。研究還發(fā)現(xiàn)FC和TC組分對氧化性損傷標志物MDA有相似的調(diào)控作用。此外,二者除了均能有效降低細胞中ROS和MDA含量,同時還能增強超氧化物歧化酶SOD的活性。(2)抗氧化因子Nrf2mRNA的相對表達隨FC、TC組分濃度的增加而升高。當FC和TC組分濃度為2.5μg/m L時,對Nrf2 m RNA的相對表達具有顯著的上調(diào)作用。(3)GSH-PX、NQO1,HO-1和γ-GCS抗氧化酶基因mRNA的相對表達隨FC和TC濃度的升高而升高。與模型組比較,FC和TC組分濃度為2.5μg/m L時,二者對四個抗氧化酶基因mRNA的表達均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)作用。以上結果表明仙鶴草活性組分FC和TC可通過激活Nrf2-ARE抗氧化信號通路從而啟動下游抗氧化酶基因的表達,最終達到改善IR模型細胞中氧化應激的作用。(4)應用q-PCR和Western blotting技術研究了仙鶴草活性組分FC和TC對IR-HepG2細胞中JNK和IRS-1/PI3K/Akt信號途徑的調(diào)控作用。(1)JNK mRNA的表達量隨著FC和TC的濃度的升高而降低。FC組分濃度為2.5μg/m L時,與模型組比較,FC干預組中JNK mRNA的相對表達量顯著降低(P0.05)。(2)IRS-1 mRNA的相對表達量與FC和TC組分濃度呈現(xiàn)劑量依賴性升高。FC和TC組分的濃度為2.5μg/mL時,與模型組比較,FC和TC干預組中IRS-1 mRNA的相對表達量顯著升高(P0.01);同樣,二者對Akt mRNA的相對表達量有著相似的調(diào)控作用。(3)與正常對照組比較,模型組中JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化和IRS-1ser307磷酸化水平均顯著升高。FC和TC組分濃度為2.5μg/mL時,與模型組相比較FC和TC干預組中JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化和IRS-1ser307磷酸化水平顯著降低。以上結果表明FC和TC組分在一定濃度下可通過下調(diào)JNK mRNA的表達和降低JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平從而上調(diào)IRS-1 mRNA的表達和降低IRS-1ser307磷酸化水平,使胰島素信號回歸正常的傳導,最終達到改善IR的作用。
【圖文】：

③ 基于 Nrf2-ARE 信號通路，研究仙鶴草活性組分 FC 和 TC 對 IR-HepG2 細胞中氧化應激的影響。藥物干預后，檢測細胞中 ROS 和 MDA 水平、抗氧化酶 SOD活性，同時還檢測氧化應激信號通路中關鍵因子 Nrf2 的 mRNA 相對表達情況以及Nrf2-ARE 信號通路下游抗氧化酶基因 NAD(P)H:醌氧化還原酶(NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶 GSH-Px、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS) 和血紅素氧合酶-1(HO-1)轉錄水平情況。明確 FC 和 TC 是否可以通過這些靶點及抗氧化途徑來改善 IR，，闡明 Nrf2-ARE 信號通路在 FC、TC 組分改善 IR- HepG2 細胞氧化應激中的重要性；④ 研究仙鶴草活性組分 FC 和TC 對 IR-HepG2 細胞中JNK和 IRS-1/PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用。應用 q-PCR 和Western blotting技術分別檢測 FC 和TC 對IR-HepG2 細胞中 JNK 以及 IRS-1/PI3K/Akt 信號傳導通路中重要基因 mRNA 的相對表達情況、關鍵蛋白表達水平和磷酸化情況的調(diào)控，闡明 FC、TC 組分通過改善 IR-HepG2 細胞氧化應激狀態(tài)進而改善 IR 的網(wǎng)絡調(diào)控關系。1.3 技術路線

注：與 5.5 mM 組比較*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，n=圖 2.1 細胞對 2-NBDG 攝取的相對熒光值Fig. 2.1 The relative fluorescence values of 2-NBDG uptake in cells濃度高糖培養(yǎng)液對 HepG2 細胞糖消耗的影響萄糖攝取實驗，說明高糖（55mM）能誘導 HepG2 細胞建步檢測 IR 模型的穩(wěn)定性，運用葡萄糖氧化酶法檢測高糖干消耗情況。不同濃度高糖 25mM、35mM、45mM、55mM每組換上含 25mM 葡萄糖的培養(yǎng)液，孵育 12h，通過葡萄糖液中葡萄糖含量，利用空白對照組上清中的糖含量減去各含量，得到葡萄糖消耗實驗結果如圖 2.2，可以看出隨著培高，葡萄糖消耗量逐漸降低。與低糖培養(yǎng)液干預組（5.5m萄糖含量在 35mM 時，與低糖培養(yǎng)液組間均存在顯著差異液葡萄糖濃度為 45mM 和 55mM 時，與低糖培養(yǎng)液組間均.001）。從圖中還可看出當培養(yǎng)液中糖含量為 55mM 時糖耗
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2672158