【摘要】：目的:在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下,觀察穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細(xì)胞泡沫化自噬和凋亡相關(guān)蛋白、基因表達(dá)的影響,從分子生物學(xué)角度探討穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細(xì)胞泡沫化自噬和凋亡途徑調(diào)控的作用機(jī)制,進(jìn)一步揭示穩(wěn)斑湯防治動脈粥樣硬化的作用機(jī)制,從而為穩(wěn)斑湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù),豐富風(fēng)痰理論的科學(xué)內(nèi)涵。材料與方法:將20只SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組,空白組及穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組各5只。穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組分別予低、中、高濃度穩(wěn)斑湯4.275g/kg、8.55g/kg、17.1g/kg灌胃,空白組給予等體積的蒸餾水灌胃,均連續(xù)灌胃7天,每天1次。在灌胃第8天,給藥2小時后,腹主動脈取血,離心后分離血清。將小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)、冷凍及復(fù)蘇,分為空白對照組,模型組,雷帕霉素組,穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組,除空白對照組外其余各組對巨噬細(xì)胞進(jìn)行泡沫化干預(yù),干預(yù)后空白對照組、模型組用10%大鼠空白血清與細(xì)胞共同培養(yǎng)48h;雷帕霉素組用雷帕霉素(終濃度10nmol/l)與細(xì)胞共同培養(yǎng)48h;穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組分別用10%穩(wěn)斑湯低、中、高濃度含藥血清與細(xì)胞共同培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。透射電鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)自噬體;采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率;采用Western Blot及免疫熒光檢測各組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白LC3B、BECLIN1、MTOR、BAX、BCL2、CASPASE3的表達(dá)水平;采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)基因Lc3b、Beclin1、Mtor、Bax、Bcl2、Caspase3的表達(dá)水平。結(jié)果:1透射電鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)自噬體空白對照組無明顯自噬體出現(xiàn);模型組可見少量自噬體出現(xiàn),自噬體呈雙層膜的囊泡狀結(jié)構(gòu),包裹有內(nèi)容物;穩(wěn)斑湯各濃度組均可見較多自噬體出現(xiàn),自噬體數(shù)量均高于模型組;雷帕霉素組也可見較多自噬體出現(xiàn),自噬體數(shù)量高于穩(wěn)斑湯各濃度組。2 MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組的OD值均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組的OD值無明顯差異(P0.05)。3流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率與空白對照組比較,模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P0.01),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均無明顯差異(P0.05);與模型組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組的細(xì)胞凋亡率有所降低(P0.05),雷帕霉素組顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組的細(xì)胞凋亡率有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4 Western Blot檢測各組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平4.1各組細(xì)胞LC3B的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組LC3B的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯低濃度組LC3B的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組LC3B的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.2各組細(xì)胞BECLIN1的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.3各組細(xì)胞MTOR的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組MTOR的蛋白表達(dá)水平有所降低(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組MTOR的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組MTOR的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.4各組細(xì)胞BAX的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.5各組細(xì)胞BCL2的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組的BCL2的蛋白表達(dá)水平有所降低(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著降低(P0.01)。4.6各組細(xì)胞CASPASE3的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著升高(P0.01)。5免疫熒光檢測各組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平5.1各組細(xì)胞LC3B的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組LC3B的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組LC3B的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組LC3B的蛋白表達(dá)水平有所降低(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.2各組細(xì)胞BECLIN1的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BECLIN1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.3各組細(xì)胞MTOR的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組MTOR的蛋白表達(dá)水平有所降低(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組MTOR的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組MTOR的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.4各組細(xì)胞BAX的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著升高(P0.01),雷帕霉素組無明顯差異(P0.05);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BAX的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.5各組細(xì)胞BCL2的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組BCL2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BCL2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.6各組細(xì)胞CASPASE3的蛋白表達(dá)水平與空白對照組比較,雷帕霉素組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),模型組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組CASPASE3的蛋白表達(dá)水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6 RT-PCR檢測各組細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平6.1各組細(xì)胞Lc3b的m RNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Lc3b的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Lc3b的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Lc3b的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.2各組細(xì)胞Beclin1的m RNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組及穩(wěn)斑湯各濃度組Beclin1的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Beclin1的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Beclin1的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.3各組細(xì)胞Mtor的m RNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Mtor的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Mtor的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Mtor的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.4各組細(xì)胞Bax的mRNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bax的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bax的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組Bax的m RNA表達(dá)水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組顯著升高(P0.01)。6.5各組細(xì)胞Bcl2的m RNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bcl2的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯低濃度組Bcl2的m RNA表達(dá)水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯各濃度組Bcl2的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01)。6.6各組細(xì)胞Caspase3的m RNA表達(dá)水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.01)。結(jié)論:1穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細(xì)胞泡沫化具有促自噬和抗凋亡作用。2穩(wěn)斑湯含藥血清通過調(diào)控巨噬細(xì)胞泡沫化自噬和凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)來發(fā)揮其促自噬和抗凋亡作用,這可能是穩(wěn)斑湯防治動脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。
【圖文】：

穩(wěn)斑湯高濃度組（電鏡，×20000 倍）雷帕霉素組（電鏡，×20000 倍）注：箭頭所示為自噬體圖 1-1 各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)自噬體的電鏡照片 MTT 法檢測各組細(xì)胞的增殖活性與空白對照組比較，模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的 OD 值均顯著降P<0.01）；與模型組比較，雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著升高（P<0.01雷帕霉素組比較，穩(wěn)斑湯低、中濃度組的 OD 值均顯著降低（P<0.01），穩(wěn)斑湯高組的 OD 值無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果見表 1-1，圖 1-2。表 1-1 各組細(xì)胞的增殖活性情況（x ±s）組別 n OD 值空白對照組 6模型組 6雷帕霉素組 60.952±0.0910.538±0.065★★0.804±0.082★★☆☆

圖 1-2 各組細(xì)胞增殖活性柱形圖術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率對照組比較，模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組的細(xì)胞凋亡率均顯著，雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均無明顯差異（P>0.05）；與模度組的細(xì)胞凋亡率有所降低（P<0.05），雷帕霉素組顯著降低（濃度組均無明顯差異（P>0.05）；與雷帕霉素組比較，穩(wěn)斑湯中所升高（P<0.05），穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高（P<0.01），穩(wěn)斑湯P>0.05）。結(jié)果見表 1-2，圖 1-3，圖 1-4。表 1-2 各組細(xì)胞凋亡率情況（X—±S）（%） n 細(xì)胞凋亡率組 33組 330.353±2.36764.450±8.161★★38.113±15.277☆☆
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李波;抑制COX-2和自噬對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];蘭州大學(xué);2013年

2 朱漢華;miRNA-323-3p靶向Pim1調(diào)控的自噬與凋亡在冠狀動脈微栓塞致心肌損傷中的作用及機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

3 趙殿臣;穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細(xì)胞泡沫化自噬和凋亡途徑調(diào)控作用機(jī)制的實驗研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 孫蘭弟;基于提高親電性的策略設(shè)計天然導(dǎo)向的抗炎試劑和自噬激活劑及其作用機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2015年

5 楊烽;Klotho對糖尿病腎臟病中細(xì)胞自噬作用的影響及其機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

6 曹文婷;miR-125b-5p在UVB影響SLE自噬中的作用機(jī)制[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

7 孫曉琪;雌二醇通過G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30 (GPR30)/ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞線粒體自噬的分子機(jī)制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

8 劉永一;自噬在棕櫚酸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

9 陳樹東;慢性頸脊毮壓迫的臨床轉(zhuǎn)歸及自噬在脊毮運動神經(jīng)元中的作用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

10 魏儀;自噬在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物致睪丸發(fā)育異常和功能障礙中的作用及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉巖林;油菜、蜀葵等植物花粉母細(xì)胞自噬現(xiàn)象鑒定及自噬基因Atg8的克隆分析[D];蘭州大學(xué);2013年

2 宋潔;自噬在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥大中的作用及青藤堿的干預(yù)作用[D];浙江工業(yè)大學(xué);2018年

3 劉雨霞;外源性H_2S對缺血再灌注后神經(jīng)元線粒體損傷的影響及其相關(guān)信號通路研究[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2019年

4 鄭璐;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬在肝細(xì)胞凋亡中的作用研究[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2019年

5 張玉;酵母Whi2對細(xì)胞自噬的影響[D];蘇州大學(xué);2018年

6 楊鵬;microRNA-24通過自噬途徑影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

7 吳習(xí)習(xí);NOD2在綿羊肺炎支原體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬中的作用機(jī)制[D];寧夏大學(xué);2018年

8 何燕;HBXIP介導(dǎo)的自噬調(diào)控及抗菌機(jī)制的研究[D];杭州師范大學(xué);2018年

9 李景峰;昆蟲自噬途徑與桿狀病毒AcMNPV侵染關(guān)系初探[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

10 崔媛旭;高ACAC通過自噬誘導(dǎo)過量NETs引發(fā)機(jī)體免疫抑制的機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2018年

本文編號：2672130