【摘要】:目的:在體外細胞培養(yǎng)條件下,觀察穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細胞泡沫化自噬和凋亡相關蛋白、基因表達的影響,從分子生物學角度探討穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細胞泡沫化自噬和凋亡途徑調(diào)控的作用機制,進一步揭示穩(wěn)斑湯防治動脈粥樣硬化的作用機制,從而為穩(wěn)斑湯的臨床應用提供科學的理論依據(jù),豐富風痰理論的科學內(nèi)涵。材料與方法:將20只SD大鼠按體重隨機分為4組,空白組及穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組各5只。穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組分別予低、中、高濃度穩(wěn)斑湯4.275g/kg、8.55g/kg、17.1g/kg灌胃,空白組給予等體積的蒸餾水灌胃,均連續(xù)灌胃7天,每天1次。在灌胃第8天,給藥2小時后,腹主動脈取血,離心后分離血清。將小鼠巨噬細胞進行傳代培養(yǎng)、冷凍及復蘇,分為空白對照組,模型組,雷帕霉素組,穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組,除空白對照組外其余各組對巨噬細胞進行泡沫化干預,干預后空白對照組、模型組用10%大鼠空白血清與細胞共同培養(yǎng)48h;雷帕霉素組用雷帕霉素(終濃度10nmol/l)與細胞共同培養(yǎng)48h;穩(wěn)斑湯低、中、高濃度組分別用10%穩(wěn)斑湯低、中、高濃度含藥血清與細胞共同培養(yǎng)48h,收集細胞后進行相關指標的檢測。透射電鏡下觀察各組細胞超微結構自噬體;采用MTT法檢測各組細胞的增殖活性;采用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率;采用Western Blot及免疫熒光檢測各組細胞自噬和凋亡相關蛋白LC3B、BECLIN1、MTOR、BAX、BCL2、CASPASE3的表達水平;采用RT-PCR檢測各組細胞自噬和凋亡相關基因Lc3b、Beclin1、Mtor、Bax、Bcl2、Caspase3的表達水平。結果:1透射電鏡下觀察各組細胞超微結構自噬體空白對照組無明顯自噬體出現(xiàn);模型組可見少量自噬體出現(xiàn),自噬體呈雙層膜的囊泡狀結構,包裹有內(nèi)容物;穩(wěn)斑湯各濃度組均可見較多自噬體出現(xiàn),自噬體數(shù)量均高于模型組;雷帕霉素組也可見較多自噬體出現(xiàn),自噬體數(shù)量高于穩(wěn)斑湯各濃度組。2 MTT法檢測各組細胞的增殖活性與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組的OD值均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組的OD值無明顯差異(P0.05)。3流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率與空白對照組比較,模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組的細胞凋亡率均顯著升高(P0.01),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均無明顯差異(P0.05);與模型組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組的細胞凋亡率有所降低(P0.05),雷帕霉素組顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組的細胞凋亡率有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4 Western Blot檢測各組細胞自噬和凋亡相關蛋白的表達水平4.1各組細胞LC3B的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組LC3B的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯低濃度組LC3B的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組LC3B的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.2各組細胞BECLIN1的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組BECLIN1的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BECLIN1的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BECLIN1的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.3各組細胞MTOR的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組MTOR的蛋白表達水平有所降低(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組MTOR的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組MTOR的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.4各組細胞BAX的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BAX的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BAX的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BAX的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。4.5各組細胞BCL2的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組的BCL2的蛋白表達水平有所降低(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著降低(P0.01)。4.6各組細胞CASPASE3的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組CASPASE3的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組CASPASE3的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組CASPASE3的蛋白表達水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著升高(P0.01)。5免疫熒光檢測各組細胞自噬和凋亡相關蛋白的表達水平5.1各組細胞LC3B的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組LC3B的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組LC3B的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組LC3B的蛋白表達水平有所降低(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.2各組細胞BECLIN1的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組BECLIN1的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組BECLIN1的蛋白表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BECLIN1的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.3各組細胞MTOR的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組MTOR的蛋白表達水平有所降低(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組MTOR的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組MTOR的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.4各組細胞BAX的蛋白表達水平與空白對照組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組BAX的蛋白表達水平有所升高(P0.05),模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組均顯著升高(P0.01),雷帕霉素組無明顯差異(P0.05);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組BAX的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BAX的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.5各組細胞BCL2的蛋白表達水平與空白對照組比較,模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組BCL2的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組BCL2的蛋白表達水平均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組BCL2的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。5.6各組細胞CASPASE3的蛋白表達水平與空白對照組比較,雷帕霉素組CASPASE3的蛋白表達水平有所升高(P0.05),模型組與穩(wěn)斑湯各濃度組均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組CASPASE3的蛋白表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中濃度組CASPASE3的蛋白表達水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6 RT-PCR檢測各組細胞自噬和凋亡相關基因的表達水平6.1各組細胞Lc3b的m RNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Lc3b的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Lc3b的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Lc3b的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.2各組細胞Beclin1的m RNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組及穩(wěn)斑湯各濃度組Beclin1的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Beclin1的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Beclin1的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.3各組細胞Mtor的m RNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Mtor的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組Mtor的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01),穩(wěn)斑湯低濃度組無明顯差異(P0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組Mtor的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01),穩(wěn)斑湯高濃度組無明顯差異(P0.05)。6.4各組細胞Bax的mRNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bax的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bax的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯高濃度組Bax的m RNA表達水平有所升高(P0.05),穩(wěn)斑湯低、中濃度組顯著升高(P0.01)。6.5各組細胞Bcl2的m RNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Bcl2的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01);與模型組比較,穩(wěn)斑湯低濃度組Bcl2的m RNA表達水平有所升高(P0.05),雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯中、高濃度組均顯著升高(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯各濃度組Bcl2的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01)。6.6各組細胞Caspase3的m RNA表達水平與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達水平均顯著降低(P0.01);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯各濃度組Caspase3的m RNA表達水平均顯著升高(P0.01)。結論:1穩(wěn)斑湯含藥血清對巨噬細胞泡沫化具有促自噬和抗凋亡作用。2穩(wěn)斑湯含藥血清通過調(diào)控巨噬細胞泡沫化自噬和凋亡相關蛋白和基因的表達來發(fā)揮其促自噬和抗凋亡作用,這可能是穩(wěn)斑湯防治動脈粥樣硬化的作用機制之一。
【圖文】:
穩(wěn)斑湯高濃度組(電鏡,×20000 倍)雷帕霉素組(電鏡,×20000 倍)注:箭頭所示為自噬體圖 1-1 各組細胞超微結構自噬體的電鏡照片 MTT 法檢測各組細胞的增殖活性與空白對照組比較,模型組、雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的 OD 值均顯著降P<0.01);與模型組比較,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯各濃度組的OD值均顯著升高(P<0.01雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯低、中濃度組的 OD 值均顯著降低(P<0.01),穩(wěn)斑湯高組的 OD 值無明顯差異(P>0.05)。結果見表 1-1,圖 1-2。表 1-1 各組細胞的增殖活性情況(x ±s)組別 n OD 值空白對照組 6模型組 6雷帕霉素組 60.952±0.0910.538±0.065★★0.804±0.082★★☆☆

圖 1-2 各組細胞增殖活性柱形圖術檢測各組細胞的凋亡率對照組比較,模型組與穩(wěn)斑湯低、中濃度組的細胞凋亡率均顯著,雷帕霉素組與穩(wěn)斑湯高濃度組均無明顯差異(P>0.05);與模度組的細胞凋亡率有所降低(P<0.05),雷帕霉素組顯著降低(濃度組均無明顯差異(P>0.05);與雷帕霉素組比較,穩(wěn)斑湯中所升高(P<0.05),穩(wěn)斑湯低濃度組顯著升高(P<0.01),穩(wěn)斑湯P>0.05)。結果見表 1-2,圖 1-3,圖 1-4。表 1-2 各組細胞凋亡率情況(X—±S)(%) n 細胞凋亡率組 33組 330.353±2.36764.450±8.161★★38.113±15.277☆☆
【學位授予單位】:遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2018
【分類號】:R285.5
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本文編號:
2672130