【摘要】：目的:本文應(yīng)用行為學(xué)和分子生物學(xué)等方法,觀察了脾陽(yáng)虛證模型大鼠海馬、下丘腦、小腸組織線粒體超微結(jié)構(gòu)與能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路的變化,以及附子理中丸干預(yù)的效果。旨為闡明脾陽(yáng)虛證“脾失健運(yùn)”的生物學(xué)機(jī)制,以及該復(fù)方“溫中健脾”功效的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法:1.動(dòng)物分組:SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只,7-8周齡,體重200g±10g,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,按體質(zhì)量分層后,采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組(空白組)、脾陽(yáng)虛模型組(模型組)、脾陽(yáng)虛+附子理中丸組(中藥組)、脾陽(yáng)虛自然恢復(fù)組(恢復(fù)組),每組15只。2.模型建立:空白組不施加任何干預(yù)因素。模型組:采用飲食失節(jié)+勞倦等復(fù)合因素方法復(fù)制脾氣虛模型。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用“苦寒瀉下”法復(fù)制脾陽(yáng)虛模型。中藥組和恢復(fù)組按模型組方法復(fù)制動(dòng)物模型。3.模型評(píng)價(jià):擬定脾陽(yáng)虛證模型大鼠類人宏觀表證:主癥:消瘦—體質(zhì)量下降,神�！\(yùn)動(dòng)能力下降和行為學(xué)變化,乏力—雙前肢拉力下降,形寒肢冷—肛溫下降,便溏—糞便含水率增加次癥:食少—進(jìn)食量減少,毛色枯槁無(wú)華評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):于動(dòng)物模型復(fù)制第28d,通過(guò)對(duì)體質(zhì)量、肛溫、進(jìn)食量、糞便含水率、運(yùn)動(dòng)能力和行為、雙前肢拉力等變化的差異性比較,半定量評(píng)價(jià)動(dòng)物模型復(fù)制是否成功,對(duì)不符合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以剔除。4.藥物干預(yù):在模型建立后,中藥組給予附子理中丸1:1水溶液灌胃,給藥量為2m L/100g·d,給藥14d�？瞻捉M和恢復(fù)組大鼠給予等量37℃生理鹽水灌胃,模型組和中藥組同時(shí)繼續(xù)施加脾陽(yáng)虛造模干預(yù)因素。各組大鼠均于實(shí)驗(yàn)的43d處死取材。5.一般狀態(tài)檢測(cè):分別于造模結(jié)束后及藥物干預(yù)后,常規(guī)方法測(cè)量體質(zhì)量、肛溫;代謝籠中方法檢測(cè)24h進(jìn)食、水量、糞便含水率等。6.行為學(xué)檢測(cè):分別于造模結(jié)束后及藥物干預(yù)后,采用Open Field test(曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)法)進(jìn)行檢測(cè)、分析直立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平均運(yùn)動(dòng)速度(運(yùn)動(dòng)距離/運(yùn)動(dòng)時(shí)間)、活動(dòng)區(qū)域等變化。7.雙前肢抓力檢測(cè):采用抓力測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定,每只大鼠連續(xù)檢測(cè)三次,取平均值。8.電鏡檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞、海馬及下丘腦組織神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。9.ELISA法檢測(cè)小腸、海馬、下丘腦組織中β-EP、cAMP和PKA含量變化。10.放射免疫法檢測(cè)小腸組織中ATP含量的變化。11.免疫組化SP法檢測(cè)小腸、海馬、下丘腦組織中β-內(nèi)啡肽μ受體的表達(dá)變化。12.RT-PCR法檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1和線粒體UCP2蛋白mRNA的表達(dá)變化。13.Western blotting法檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1和線粒體UCP2蛋白的表達(dá)變化。14.化學(xué)熒光法檢測(cè)海馬和下丘腦組織中ROS含量變化。15.統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)均采用(?)±S表示,應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析法或秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.與空白組比較,模型組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、肛溫明顯下降(P均0.01),糞便含水率明顯升高(P0.01),直立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平均運(yùn)動(dòng)速度和雙前肢拉力明顯低于空白組(P均0.01);與模型組比較,中藥組大鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量呈現(xiàn)明顯上升(P均0.01),糞便含水率降低(P0.01),直立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)距離、平均運(yùn)動(dòng)速度和雙前肢拉力明顯高于模型組(P均0.01),脾陽(yáng)虛證類人宏觀表征明顯改善;恢復(fù)組大鼠上述指標(biāo)變化與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.與空白組比較,模型組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞、海馬和下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯損傷,線粒體減少、腫脹,線粒體嵴腫脹斷裂,空泡化;與模型組比較,中藥組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞、海馬和下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷程度減輕,線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,線粒體嵴排列規(guī)則,腫脹、斷裂和空泡化減少;恢復(fù)組大鼠上述組織細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化與模型組相同。3.與空白組比較,模型組和恢復(fù)組大鼠小腸組織中ATP含量顯著降低(P均0.01);與模型組比較,中藥組大鼠小腸組織中ATP含量升高(P0.01);與中藥組比較,恢復(fù)組大鼠小腸組織中ATP含量顯著降低(P0.01)。4.與空白組比較,模型組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中β-EP含量和μ受體表達(dá)明顯升高(P均0.01);與模型組比較,中藥組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中β-EP含量和μ受體表達(dá)降低(P0.05或P0.01);恢復(fù)組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中β-EP含量和μ受體表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.與空白組比較,模型組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中cAMP和PKA含量明顯降低(P均0.01);與模型組比較,中藥組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中cAMP和PKA含量明顯升高(P0.05或P0.01);恢復(fù)組大鼠小腸、海馬和下丘腦組織中cAMP和PKA含量低于中藥組(P0.05或P0.01)。6.與空白組比較,模型組、中藥組、恢復(fù)組大鼠海馬和下丘腦組織中ROS含量顯著升高(P均0.01);與模型組比較,中藥組大鼠海馬和下丘腦組織中ROS含量顯著降低(P均0.01);與中藥組比較,恢復(fù)組大鼠海馬和下丘腦組織中ROS含量高于中藥組(P均0.01)7.與空白組比較,模型組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1 mRNA表達(dá)明顯降低(P均0.01),線粒體UCP2 mRNA表達(dá)明顯升高(P0.01);與模型組比較,中藥組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1 mRNA表達(dá)明顯上升(P均0.01),線粒體UCP2mRNA表達(dá)明顯降低(P0.01);與中藥組比較,恢復(fù)組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1 mRNA表達(dá)降低(P0.05或P0.01),線粒體UCP2 mRNA表達(dá)升高(P0.05)。8.與空白組比較,模型組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1蛋白表達(dá)明顯降低(P均0.01),線粒體UCP2蛋白表達(dá)明顯升高(P0.01);與模型組比較,中藥組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1蛋白表達(dá)上升(P均0.05),線粒體UCP2蛋白表達(dá)明顯降低(P0.01);與中藥組比較,恢復(fù)組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1蛋白表達(dá)降低(P0.05或P0.01),線粒體UCP2蛋白表達(dá)升高(P0.05)。結(jié)論:1.脾陽(yáng)虛證模型大鼠中樞及小腸上皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯損傷,附子理中丸能夠不同程度逆轉(zhuǎn)其損傷。2.脾陽(yáng)虛證模型大鼠中樞及小腸上皮細(xì)胞β-EP-cAMP-PKA信號(hào)通路活動(dòng)抑制,附子理中丸能夠逆轉(zhuǎn)此異常變化。3.脾陽(yáng)虛證模型大鼠小腸上皮細(xì)胞中CREB、Sirt1 mRNA與蛋白表達(dá)明顯下調(diào),而線粒體UCP2表達(dá)上調(diào);附子理中丸能夠使其逆轉(zhuǎn)。4.脾陽(yáng)虛證模型大鼠海馬、下丘腦組織ROS含量升高,小腸組織中ATP含量下降;附子理中丸能夠降低海馬、下丘腦組織ROS,提高小腸組織ATP含量。5.附子理中丸“溫中健脾”的作用機(jī)制,可能參與了中樞神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)保護(hù),提高β-EP-cAMP-PKA信號(hào)通路活動(dòng),促進(jìn)中樞及小腸組織細(xì)胞線粒體能量代謝過(guò)程。
【圖文】：

（P 均＞0.05）；②第 42d 與空白組比較，模型組、中藥組降（P 均＜0.01）；③第 42d 與模型組比較，中藥組和恢復(fù)P 均＜0.01）；④第 42d 與中藥組比較，恢復(fù)組大鼠體質(zhì)量表1-1 各組大鼠體質(zhì)量變化（ X ±S）別 N體質(zhì)量（g）第 1d 第 42d組 10 199.07±6.50 341.40±9.18組 10 198.43±6.44 171.07±4.06*組 10 199.39±4.07 236.64±8.14*組 10 199.47±6.04 217.30±7.90*組：**P＜0.01；vs.模型組：＃＃P＜0.01；vs.中藥組：△△P＜0.01。

△△P＜0.01。圖1-2 第42d各組大鼠肛溫變化情況比較3．各組大鼠進(jìn)食量的變化四組大鼠的進(jìn)食量變化情況見(jiàn)表 1-3、圖 1-3。結(jié)果表明：①第 1d 四組大鼠進(jìn)食量組間比較無(wú)差異（P 均＞0.05）；②第 42d 與空白組比較，模型組、中藥組和恢復(fù)組進(jìn)食量明顯下降（P 均＜0.01）；③第 42d 與模型組比較，中藥組進(jìn)食量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；恢復(fù)組進(jìn)食量與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；④第 42d 與中藥組比較，恢復(fù)組進(jìn)食量低于中藥組，，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2670640