發(fā)布時(shí)間：2020-05-19 08:39

【摘要】：背景與目的血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)是由侵襲性腫瘤細(xì)胞排列構(gòu)成的不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)。它可以模擬正常的血管,以確保腫瘤充足的血液供應(yīng)。VM被證明與惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān),是抗血管生成治療的主要障礙。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤VM形成的方法,這對(duì)改善腫瘤治療具有重要的臨床意義。馬錢子堿是從傳統(tǒng)藥用植物馬錢子的種子中提取的中藥單體,在多種癌癥模型中都表現(xiàn)出抗腫瘤活性。本課題組前期研究已證明馬錢子堿具有潛在的抗腫瘤血管生成作用,但更深入的機(jī)制并不清楚。本研究從另外一種角度,探討馬錢子堿在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)中的作用及其機(jī)制。研究方法MTT法測(cè)定不同濃度的馬錢子堿處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用;Hoechst33342/碘化丙啶(HO/PI)染色檢測(cè)不同濃度的馬錢子堿誘導(dǎo)MDAMB-231細(xì)胞的死亡情況;Annexin V-FITC/PI雙染后,采用流式檢測(cè)不同濃度馬錢子堿處理引起MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況;通過劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)馬錢子堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;用免疫熒光染色,在激光共聚焦下觀察馬錢子堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞骨架微絲和微管的影響。然后在體外利用Matrigel基質(zhì)膠構(gòu)建人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231血管生成擬態(tài)模型;PAS染色檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的能力;進(jìn)一步探明不同劑量的馬錢子堿對(duì)血管生成擬態(tài)形成的影響;最后采用蛋白印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)不同濃度馬錢子堿處理后,細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和血管生成擬態(tài)的通路相關(guān)蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平變化。結(jié)果1.在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中,馬錢子堿以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞增殖,并且僅在較高濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。蛋白印跡分析還顯示,馬錢子堿僅在較高濃度時(shí),可以通過增加的剪切后的caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.通過劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)馬錢子堿以劑量依賴的方式抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲。3.在激光共聚焦顯微鏡下觀察,我們首次發(fā)現(xiàn),馬錢子堿可以破壞MDA-MB-231細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和微管結(jié)構(gòu),從而削弱侵襲性腫瘤的一些特性,如遷移、侵襲,并且這可能是馬錢子堿抑制VM形成的機(jī)制之一。4.在Matrigel基質(zhì)膠上,MDA-MB-231細(xì)胞具有形成VM結(jié)構(gòu)的能力。進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)小管數(shù)量、交叉點(diǎn)數(shù)量、小管平均長(zhǎng)度結(jié)果表明,馬錢子堿呈劑量依賴的抑制VM形成。5.WB結(jié)果表明,不同濃度馬錢子堿處理MDA-MB-231細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)血管生成擬態(tài)標(biāo)志蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平呈劑量依賴式下調(diào)。結(jié)論馬錢子堿抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管生成擬態(tài)形成,其機(jī)制與細(xì)胞骨架的破壞以及Eph A2、MMP-2、MMP-9蛋白的下調(diào)有關(guān)。
【圖文】：

1 馬錢子堿對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的抑制作用 1a 顯示了馬錢子堿的分子結(jié)構(gòu)。首先，我們?cè)陲@微鏡下觀察到馬錢子堿B-231 細(xì)胞的抑制作用。與對(duì)照組細(xì)胞相比，馬錢子堿引起細(xì)胞形態(tài)改狀變圓和縮小，長(zhǎng)梭形逐漸喪失（圖 1b）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照以及馬錢子堿組（0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 或 2 mM）處理 MDA-M 24h 后，各組相對(duì)空白對(duì)照組的細(xì)胞活力分別為 98.200±0.998, 0.97.737±0.771, 93.80±1.068, 76.749±2.337, 52.038±2.961, 28.433±0.484（圖 1高濃度（1, 2 mM）的馬錢子堿處理細(xì)胞 24 小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)明顯減少（據(jù)來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，計(jì)算可得，馬錢子堿對(duì) MDA-MB-23數(shù)抑制濃度（IC50）為 1.172mM。這些數(shù)據(jù)表明，馬錢子堿處理對(duì) MDA胞生長(zhǎng)具有劑量依賴性的抑制作用。因此，我們使用低于 IC50 的劑量實(shí)驗(yàn)。

Fig 1. The effect of brucine on MDA-MB-231 cell viability. (a) The chemical structure of brucine; (b)Bright field images; (c) Cell viability. The scale bar is of 100 μm.3.2 馬錢子堿誘導(dǎo) MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡根據(jù) Hoechst33342/碘化丙啶（PI）染色測(cè)定結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)馬錢子堿處理 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 小時(shí)后，較高濃度（1, 2 mM）馬錢子堿處理組，細(xì)胞死亡明顯增加，說明馬錢子堿誘導(dǎo)劑量依賴性細(xì)胞死亡（圖 2a）。進(jìn)一步，我們用膜聯(lián)蛋白 V/PI染色試劑盒對(duì)細(xì)胞染色，通過 FACS 測(cè)量細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明馬錢子堿可以引起細(xì)胞凋亡，但在 1mM 濃度下僅有 4.27%的細(xì)胞凋亡（圖 2b）。蛋白印跡分析還顯示，馬錢子堿僅在較高濃度時(shí)，可以通過增加的剪切后的 caspase-3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖 2c）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李麗清;流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定馬錢子堿[J];山東礦業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);1998年03期

2 吳紹安;馬錢子生品、炮制品及其皮毛的生物堿含量比較[J];中成藥;1988年12期

3 馬愛蓮;王憲齡;;馬錢子的藥性當(dāng)易[J];西北藥學(xué)雜志;1988年02期

4 朱燕娜,鮑夢(mèng)周,曹永舒,黃幼田,劉風(fēng)芝,常宇明;馬錢子堿和士的寧鎮(zhèn)痛作用的初步探討[J];河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1989年04期

5 沙德智,竇金輝,李飛,唐盈;馬錢子中生物堿含量分布及其與炮制的關(guān)系[J];中國(guó)中藥雜志;1989年01期

6 林武俊;;跳骨片中馬錢子炮制工藝的改進(jìn)[J];福建中醫(yī)藥;1989年06期

7 鄭順山;;馬錢子在骨傷科的應(yīng)用[J];河北中醫(yī);1989年05期

8 郭文生，李軍，，金紅華，張澤勇，聶云杰，呂揚(yáng)，鄭啟泰;利用主－客體系分離馬錢子中馬錢子堿的研究[J];中國(guó)藥物化學(xué)雜志;1995年01期

9 管慶霞;張悅;鄒淑君;孫爽;于欣;張偉兵;華曉丹;楊志欣;李秀巖;王艷宏;;馬錢子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的表征及體外釋放行為分析[J];中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志;2019年08期

10 王燕軍;氣相色譜/質(zhì)譜檢驗(yàn)馬錢子堿方法[J];刑事技術(shù);2001年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳丹;王學(xué)峰;李霆雷;李勁梅;席志芹;;馬錢子堿致癇毒理作用及其機(jī)制探討[A];第十一屆全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

2 王藝華;;馬錢子堿對(duì)多發(fā)性骨髓瘤骨病中成骨及破骨細(xì)胞代謝的影響[A];第13屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2011年

3 黨雪平;段連生;張修華;王升富;;馬錢子堿在碳納米管粉末微電極上的電化學(xué)行為及分析應(yīng)用[A];湖北省化學(xué)化工學(xué)會(huì)第十一屆分析化學(xué)專業(yè)年會(huì)論文集[C];2007年

4 劉陶世;蔡寶昌;趙新慧;鄧旭坤;黃耀洲;;馬錢子堿納米脂質(zhì)體的制備研究[A];中國(guó)當(dāng)代新醫(yī)藥論叢[C];2004年

5 劉若軒;李麗明;吳菲;李阿榮;劉夏雯;郭潔文;;脂質(zhì)體不同給藥方式下馬錢子堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異[A];2017年廣東省藥師周大會(huì)論文集[C];2016年

6 劉若軒;李麗明;郭潔文;李阿榮;;含毒性中藥馬錢子中成藥的劑型與工藝分析[A];2016年廣東省藥師周大會(huì)論文集[C];2015年

7 吳玉紅;吳維蓉;王曉波;;一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定肝臟中馬錢子堿和士的寧含量的方法[A];第五次全國(guó)法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];1996年

8 劉旭海;龔千鋒;周道根;;馬錢子研究綜述[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥炮制分會(huì)2008年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

9 呂樺;宋金春;鄧睿園;以盛;;馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒的制備研究[A];2008年中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第八屆中國(guó)藥師周論文集[C];2008年

10 翟春燕;魏武;紀(jì)愛芳;申徐良;張國(guó)香;楊建斌;王海麗;梁莉;魏明霞;;馬錢子堿對(duì)再生障礙性貧血患者T細(xì)胞分泌功能及增殖的影響[A];第十一屆山西省血液病學(xué)術(shù)年會(huì)暨國(guó)家級(jí)及山西省繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 趙楠;馬錢子和格木內(nèi)生真菌的化學(xué)成分及生物活性研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2012年

2 許妍妍;基于配伍理論的痹祺膠囊藥代動(dòng)力學(xué)研究[D];天津大學(xué);2010年

3 劉菲;生物堿類物質(zhì)檢測(cè)方法及毒性分析研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

4 楊秀敏;膠束溶劑堆積在線富集—毛細(xì)管電泳法在中藥材成分分析中的應(yīng)用[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 宋萬(wàn)吉;馬錢子堿對(duì)三陰性乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及其可能機(jī)制探討[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

2 徐夢(mèng)冉;馬錢子堿對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231血管生成擬態(tài)的影響及相關(guān)機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

3 楊薇;馬錢子堿貼劑研制及局部鎮(zhèn)痛與傳遞研究[D];湘潭大學(xué);2017年

4 王冬月;馬錢子減毒總生物堿的制備與評(píng)價(jià)[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 豐偉;馬錢子巴布劑的研究[D];廣東藥科大學(xué);2017年

6 梁小婷;馬錢子堿聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2017年

7 童俊;馬錢子堿、士的寧與人血清白蛋白間的非共價(jià)結(jié)合作用研究[D];湖北大學(xué);2011年

8 葉敏;馬錢子堿、次烏頭堿的體外吸收機(jī)制及其它們分別與甘草苷的轉(zhuǎn)運(yùn)相互作用研究[D];湖北大學(xué);2012年

9 陳娟;透明質(zhì)酸包裹馬錢子堿白蛋白納米粒的研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

10 李洪霞;毛細(xì)管電泳不同分離技術(shù)在中草藥分析中的應(yīng)用[D];首都師范大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2670630