發(fā)布時間：2020-05-19 08:39

【摘要】：背景與目的血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)是由侵襲性腫瘤細胞排列構(gòu)成的不依賴于內(nèi)皮細胞的管狀結(jié)構(gòu)。它可以模擬正常的血管,以確保腫瘤充足的血液供應(yīng)。VM被證明與惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān),是抗血管生成治療的主要障礙。因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤VM形成的方法,這對改善腫瘤治療具有重要的臨床意義。馬錢子堿是從傳統(tǒng)藥用植物馬錢子的種子中提取的中藥單體,在多種癌癥模型中都表現(xiàn)出抗腫瘤活性。本課題組前期研究已證明馬錢子堿具有潛在的抗腫瘤血管生成作用,但更深入的機制并不清楚。本研究從另外一種角度,探討馬錢子堿在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞形成血管生成擬態(tài)中的作用及其機制。研究方法MTT法測定不同濃度的馬錢子堿處理對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用;Hoechst33342/碘化丙啶(HO/PI)染色檢測不同濃度的馬錢子堿誘導(dǎo)MDAMB-231細胞的死亡情況;Annexin V-FITC/PI雙染后,采用流式檢測不同濃度馬錢子堿處理引起MDA-MB-231細胞凋亡情況;通過劃痕實驗和細胞侵襲實驗,檢測馬錢子堿對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響;用免疫熒光染色,在激光共聚焦下觀察馬錢子堿對MDA-MB-231細胞骨架微絲和微管的影響。然后在體外利用Matrigel基質(zhì)膠構(gòu)建人乳腺癌細胞MDA-MB-231血管生成擬態(tài)模型;PAS染色檢測MDA-MB-231細胞形成血管生成擬態(tài)的能力;進一步探明不同劑量的馬錢子堿對血管生成擬態(tài)形成的影響;最后采用蛋白印跡法(Western blot,WB)檢測不同濃度馬錢子堿處理后,細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和血管生成擬態(tài)的通路相關(guān)蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表達水平變化。結(jié)果1.在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中,馬錢子堿以劑量依賴的方式抑制細胞增殖,并且僅在較高濃度下誘導(dǎo)細胞凋亡。蛋白印跡分析還顯示,馬錢子堿僅在較高濃度時,可以通過增加的剪切后的caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡。2.通過劃痕實驗和細胞侵襲實驗,我們發(fā)現(xiàn)馬錢子堿以劑量依賴的方式抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。3.在激光共聚焦顯微鏡下觀察,我們首次發(fā)現(xiàn),馬錢子堿可以破壞MDA-MB-231細胞的F-肌動蛋白細胞骨架和微管結(jié)構(gòu),從而削弱侵襲性腫瘤的一些特性,如遷移、侵襲,并且這可能是馬錢子堿抑制VM形成的機制之一。4.在Matrigel基質(zhì)膠上,MDA-MB-231細胞具有形成VM結(jié)構(gòu)的能力。進一步通過統(tǒng)計小管數(shù)量、交叉點數(shù)量、小管平均長度結(jié)果表明,馬錢子堿呈劑量依賴的抑制VM形成。5.WB結(jié)果表明,不同濃度馬錢子堿處理MDA-MB-231細胞后,細胞內(nèi)血管生成擬態(tài)標(biāo)志蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表達水平呈劑量依賴式下調(diào)。結(jié)論馬錢子堿抑制人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231的細胞遷移、細胞侵襲和血管生成擬態(tài)形成,其機制與細胞骨架的破壞以及Eph A2、MMP-2、MMP-9蛋白的下調(diào)有關(guān)。
【圖文】：

1 馬錢子堿對 MDA-MB-231 細胞增殖的抑制作用 1a 顯示了馬錢子堿的分子結(jié)構(gòu)。首先，我們在顯微鏡下觀察到馬錢子堿B-231 細胞的抑制作用。與對照組細胞相比，馬錢子堿引起細胞形態(tài)改狀變圓和縮小，長梭形逐漸喪失（圖 1b）。MTT 實驗結(jié)果表明，空白對照以及馬錢子堿組（0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 或 2 mM）處理 MDA-M 24h 后，各組相對空白對照組的細胞活力分別為 98.200±0.998, 0.97.737±0.771, 93.80±1.068, 76.749±2.337, 52.038±2.961, 28.433±0.484（圖 1高濃度（1, 2 mM）的馬錢子堿處理細胞 24 小時后，細胞數(shù)明顯減少（據(jù)來自三次獨立實驗結(jié)果。此外，計算可得，馬錢子堿對 MDA-MB-23數(shù)抑制濃度（IC50）為 1.172mM。這些數(shù)據(jù)表明，馬錢子堿處理對 MDA胞生長具有劑量依賴性的抑制作用。因此，我們使用低于 IC50 的劑量實驗。

Fig 1. The effect of brucine on MDA-MB-231 cell viability. (a) The chemical structure of brucine; (b)Bright field images; (c) Cell viability. The scale bar is of 100 μm.3.2 馬錢子堿誘導(dǎo) MDA-MB-231 細胞凋亡根據(jù) Hoechst33342/碘化丙啶（PI）染色測定結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)馬錢子堿處理 MDA-MB-231 細胞 24 小時后，較高濃度（1, 2 mM）馬錢子堿處理組，細胞死亡明顯增加，說明馬錢子堿誘導(dǎo)劑量依賴性細胞死亡（圖 2a）。進一步，我們用膜聯(lián)蛋白 V/PI染色試劑盒對細胞染色，通過 FACS 測量細胞凋亡情況，實驗結(jié)果說明馬錢子堿可以引起細胞凋亡，但在 1mM 濃度下僅有 4.27%的細胞凋亡（圖 2b）。蛋白印跡分析還顯示，馬錢子堿僅在較高濃度時，可以通過增加的剪切后的 caspase-3 誘導(dǎo)細胞凋亡（圖 2c）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2670630