【摘要】：目的:觀察藥物β-七葉皂苷鈉對信號適配器p62蛋白和自噬表達的影響以及p62蛋白和自噬在結(jié)直腸癌細胞對β-七葉皂苷鈉化療敏感性的作用;探討p62蛋白影響結(jié)直腸癌細胞對β-七葉皂苷鈉化療敏感性的機制。方法:CCK8法和克隆形成實驗檢測β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞增殖作用的影響;Western blot檢測不同濃度不同時間β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞p62的影響;PCR檢測不同濃度β-七葉皂苷鈉對p62 m RNA水平的影響;Western blot檢測加入NAC后β-七葉皂苷鈉對p62表達的影響;Western blot和流式細胞術(shù)檢測β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響;Western blot和細胞免疫熒光法檢測β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞DNA損傷的影響;采用質(zhì)粒FLAG-p62過表達和小干擾RNA干擾腫瘤細胞內(nèi)p62蛋白水平后,CCK8法檢測過表達和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞增殖活力的影響,流式細胞術(shù)檢測過表達和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響,Western blot檢測過表達和干擾p62聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白和DNA損傷修復(fù)蛋白表達的影響;裸鼠皮下成瘤實驗檢測干擾p62表達對結(jié)直腸癌生長及其對β-七葉皂苷鈉化療療效的影響;使用ATM抑制劑聯(lián)合β-七葉皂苷鈉后,Western blot和流式細胞術(shù)檢測ATM抑制后β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響;Western blot檢測β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞自噬的影響,CCK8和Western blot檢測干擾Atg5表達聯(lián)合β-七葉皂苷鈉對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡和DNA損傷的影響。結(jié)果:(1)CCK8和克隆形成實驗結(jié)果顯示,β-七葉皂苷鈉以濃度依賴性和時間依賴性方式抑制HCT116和HCT8細胞的細胞活力和集落形成數(shù)。(2)β-七葉皂苷鈉作用于結(jié)直腸癌細胞誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示β-七葉皂苷鈉以濃度依賴性和時間依賴性方式誘導(dǎo)DNA損傷,同時,Western blot結(jié)果顯示β-七葉皂苷鈉以相同方式上調(diào)p62,p62的上調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,并能被NAC部分消除。(3)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的p62上調(diào)對β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷具有保護作用,因為使用兩種si RNA干擾p62表達后明顯增強β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷,而過表達p62減少β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷。(4)Western blot和流式細胞術(shù)顯示β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)濃度依賴性和時間依賴性的細胞凋亡;與DNA損傷結(jié)果類似,干擾p62表達增加β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細胞增殖抑制和凋亡,過表達p62降低β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細胞增殖抑制和凋亡。(5)通過裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn),干擾p62表達抑制結(jié)直腸癌的生長,同時也增加其對β-七葉皂苷鈉的化療敏感性。(6)機制研究表明p62調(diào)控的DNA損傷與β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān),Western blot和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,干擾p62表達聯(lián)合ATM抑制劑KU55933增強了β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的DNA損傷并進一步增加了β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細胞凋亡。(7)Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)細胞內(nèi)自噬水平激活,干擾Atg5表達抑制細胞自噬增加β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)的細胞增值抑制、DNA損傷和細胞凋亡。結(jié)論:(1)β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞細胞p62、自噬和DNA損傷以濃度依賴性和時間依賴性上調(diào)。(2)p62和自噬降低結(jié)直腸癌細胞對β-七葉皂苷鈉的化療敏感性,其分子機制涉及細胞凋亡和DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。(3)p62介導(dǎo)的ATM/γH2AX信號通路和β-七葉皂苷鈉介導(dǎo)的自噬可能是β-七葉皂苷鈉發(fā)揮抗腫瘤作用的潛在靶標,為臨床上β-七葉皂苷鈉治療結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 2. β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞凋亡。（A-B）β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)細胞凋亡細胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0 60 μg/ml）作用 12 小時，，細胞凋亡數(shù)值通過式細胞儀分析，右方是細胞凋亡統(tǒng)計圖。（C-D）β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白上調(diào)細胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0 80 μg/ml）作用 12 小時或相同濃度 β-七葉皂

圖 3. β-七葉皂苷鈉誘導(dǎo) p62 上調(diào)。（A）細胞經(jīng)過不同濃度 β-七葉皂苷鈉（0μg/ml）作用 12 小時或相同濃度 β-七葉皂苷鈉（60 μg/ml）作用不同時間（3-24 小時Western blot 檢測 p62 蛋白的表達。（B）p62 蛋白的量化統(tǒng)計圖。（C）細胞經(jīng)過不濃度 β-七葉皂苷鈉（0 80 μg/ml）作用 12 小時，qPCR 實驗檢測 p62 的 mRNA 水平
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

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本文編號：2669863