【摘要】：蟲草屬真菌[Cordyceps(Fr.)Link]是一類有著相似的生活周期和侵染機制的蟲生真菌,差異僅在于寄主昆蟲和生長條件的不同。九州蟲草(Cordyceps kyushuensis Kob)是目前已知的唯一以豆天蛾(Clanis bilineata Walker)幼蟲為寄主的蟲草,發(fā)現(xiàn)于我國的山東蒙山、遼寧沈陽東部山區(qū)等,2000年被確認為我國的新記錄種,其無性型鑒定為九州輪枝菌(Verticillium kyushuensis)。研究表明,九州蟲草中有蟲草素、噴司他汀、蟲草酸、黃酮類物質(zhì)、多糖、氨基酸等活性成分。其中,蟲草素通過誘導非小細胞肺癌細胞的凋亡、特異性抑制人宮頸癌細胞mRNA轉(zhuǎn)錄等發(fā)揮相應的抗腫瘤作用,亦可通過作用于成熟樹突狀細胞誘導調(diào)節(jié)T細胞增殖而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;合用蟲草素與噴司他汀不僅可以有效治療感染非洲錐蟲病的小鼠,美國OncoVista公司更是在FDA批準下共用蟲草素和噴司他汀治療末端脫氧核苷酸陽性白血病細胞(TdT+)等。雖然九州蟲草中某些單一活性成分的藥理作用已得到證明,但是眾多成分所帶來的藥理活性并不是簡單的加和作用,這使其在臨床應用時面臨著“化學成分多樣,作用機制不明確,科學理論未闡明”的瓶頸,不僅是九州蟲草,我國傳統(tǒng)中藥的應用也因此受到限制和約束。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展和進步,出現(xiàn)了以基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學等為代表的微生物組學技術和以“整體、多層次網(wǎng)絡認知生物體”為核心的系統(tǒng)藥理學,它們?yōu)閭鹘y(tǒng)中藥的現(xiàn)代化發(fā)展、中藥來源的新型藥物研發(fā)提供了嶄新的思路。結(jié)合多種組學手段,從分子水平上獲取完整的生物體信息,有助于闡明生物體不同發(fā)育階段、疾病/健康狀態(tài)下的基因和蛋白變化。系統(tǒng)藥理學和系統(tǒng)生物學“多重藥物對應多重靶點和多種疾病”的思維觀念與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的辯證思維不謀而合。藥物與人體內(nèi)的靶點(基因、蛋白)彼此作用形成了一個龐大和穩(wěn)健的網(wǎng)絡,通過調(diào)控其對應的作用靶點、相應的生物進程來治療疾病。在這種多重組分和多重靶點的協(xié)同作用體系下,通過數(shù)學計算預測和分子生物學途徑來研究藥物,結(jié)合組學技術提供實用有效的方法快速研究其作用靶點,從分子水平上闡明、驗證傳統(tǒng)中藥的治療效果,應用藥理學的新概念對傳統(tǒng)中藥的發(fā)展做出一定的貢獻和推動。本論文研究的對象為九州蟲草(Cordyceps kyushuensis Kob),應用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學技術研究不同發(fā)育時期的基因及蛋白表達差異;對九州蟲草線粒體全基因組進行測序并分析;在全面總結(jié)九州蟲草活性成分的前提下,使用系統(tǒng)藥理學的技術手段和分析方法對九州蟲草潛在的藥理活性做出預測,根據(jù)預測結(jié)果,結(jié)合斑馬魚疾病模型對九州蟲草水提物的降血糖和降血脂效果進行了驗證實驗,同時解析高糖/給藥狀態(tài)下自噬表達的改變,從理論和實踐兩方面對其進行驗證。本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1.首次對九州蟲草四個發(fā)育時期(菌絲時期CKK1、轉(zhuǎn)色時期CKK2、原基形成初期CKK3和子實體時期CKK4)的轉(zhuǎn)錄組和首尾時期(CKK1,CKK4)的蛋白質(zhì)組進行測序和分析,同時鑒定子實體發(fā)育時期的關鍵酶類。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中,四個發(fā)育時期分別轉(zhuǎn)錄出了 21351(CKK1),17858(CKK2),17869(CKK3),17088(CKK4)個unigenes。對四個發(fā)育時期的基因進行兩兩比對分析,CKK1-VS-CKK2的878個差異表達基因(DEGs)中有552個上調(diào)表達基因(up-DEGs);CKK1-VS-CKK3的811個DEGs中有536 個 up-DEGs;CKK1-VS-CKK4 的 718 個 DEGs 中有 479 個 up-DEGs;CKK2-VS-CKK3 的 1057 個 DEGs 中有 566 個 up-DEGs;CKK2-VS-CKK4 的912個DEGs 中有493 個up-DEGs;CKK3-VS-CKK4 的 907個 DEGs 中有453個up-DEGs。分別對DEGs進行KEGG,GO和KOG注釋分析,鑒定了子實體發(fā)育時期涉及的關鍵酶類,42個unigenes參與了子實體發(fā)育時期,其中有12個 unigenes 屬于 NADH dehydrogenase subunit,2 個 unigenes 屬于 NADPH oxidase,2 個unigenes屬于 Pheromone receptor,9 個 unigenes屬于 G protein subunit,1 個unigene 屬于 adenylyl cyclase,2 個 unigenes屬于 MAPK通路等,且KEGG結(jié)果顯示MAPK信號通路是被顯著富集的通路之一,表明子實體發(fā)育可能更依賴于MAPK信號通路。蛋白質(zhì)組測序中兩個樣本時期共鑒定出4185個蛋白質(zhì),根據(jù)FC1.5或FC0.67的條件篩選出445個差異蛋白,其中224個上調(diào)表達蛋白,221個下調(diào)表達蛋白,分別對它們進行了 KEGG,GO,KOG功能注釋分析。2.在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的基礎上,利用Blast對九州蟲草活性成分蟲草素和噴司他汀的合成基因簇進行了鑒定。噴司他汀作為蟲草素的體內(nèi)“保護者”,可以保護蟲草素在體內(nèi)免被腺苷脫氨酶降解,從而增強其體內(nèi)藥理活性。經(jīng)鑒定二者在九州蟲草中共用同一個合成基因簇,該合成基因簇上包含4個基因,分別命名為ck1-ck4。其中,ck1基因的保守區(qū)為氧化還原/脫氫酶區(qū)域,ck2基因的保守區(qū)為依賴金屬的磷酸水解酶HDc家族,ck3基因的保守區(qū)域為N末端核苷酸激酶和C末端HisG區(qū)域,ck4被blast注釋為潛在的ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運子。3.對九州蟲線粒體全基因組進行測序并分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析進化過程。九州蟲草的線粒體基因組長度為37520 bp,GC含量為26.55%,含有22個編碼基因(3個ATP合成酶F0亞基,1個脫血紅素細胞色素β基因,3個細胞色素氧化酶亞基,5個NADH脫氫酶亞基,1個NADH-醌氧化還原酶和9個開放閱讀框)和2 1個非編碼基因(19個tRNA,1個rrnL和1個rrnS)。系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示,九州蟲草與冬蟲夏草分離的時間很早,親緣關系較遠;而與蛹蟲草有著較近的親緣關系。該進化結(jié)果與近年來對蟲草屬的重新劃分相一致,冬蟲夏草被劃分為Ophiocordycipitaceae科的Ophiocordycors屬,而蛹蟲草與九州蟲草依舊同屬于Cordycipitaceae科的Cordyceps屬。4.用大米和豆類培養(yǎng)基培養(yǎng)九州蟲草,在7天、20天和30天時分別取樣檢測蟲草素的含量變化,尋找最優(yōu)化的高產(chǎn)培養(yǎng)基。蟲草素含量的增加呈時間依賴型,在五種培養(yǎng)基中,黑豆培養(yǎng)基中蟲草素含量最高,其次是黃豆培養(yǎng)基,大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的蟲草素含量最低。在蟲草素發(fā)酵中,黑豆和黃豆培養(yǎng)基是最優(yōu)培養(yǎng)基。同時進行了九州蟲草對大米和四種豆類培養(yǎng)基抗氧化活性的作用。結(jié)論為九州蟲草發(fā)酵后的培養(yǎng)基抗氧化活性(ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、鐵離子還原抗氧化力)均有不同程度的增強。5.基于系統(tǒng)藥理學的方法預測九州蟲草的藥理活性。以口服生物利用度"g30%作為篩選九州蟲草藥理活性成分的標準,共得到42個候選化合物,對應317個人類靶點。根據(jù)課題組先前研究積累及后續(xù)研究需要,選擇五種疾病(非小細胞肺癌、組織淋巴瘤、粒細胞性白血病、高血糖和高血脂)構(gòu)建“化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡”和“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡”。分析網(wǎng)絡中的拓撲結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示:前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、腫瘤壞死因子(TNF)等靶點在非小細胞肺癌、組織淋巴瘤和粒細胞性白血病的治療中發(fā)揮著較為重要的作用,其中PTGS2在良惡腫瘤中均高表達;β1、β2腎上腺素能受體(ADRB1、ADRB2)均為高血糖和高血脂的潛在治療靶點,且胰島素抵抗和脂肪細胞因子信號通路同時富集于高血糖和高血脂癥,佐證了人體內(nèi)的糖代謝和脂代謝存在著千絲萬縷的內(nèi)在聯(lián)系。通過對活性成分、靶點蛋白、疾病之間的潛在關系進行解析,初步解析九州蟲草治療疾病的潛在分子生物學機制。6.在先前預測得到的藥理學活性基礎上,著重探索九州蟲草的降糖、降脂效果,同時探究高糖水平對自噬造成的改變。使用20 g/L的葡萄糖溶液浸泡成年斑馬魚構(gòu)建斑馬魚高血糖模型和1%蛋黃水飼喂斑馬魚幼魚構(gòu)建高血脂模型,隨后使用不同濃度的九州蟲草水提物對其進行給藥處理,檢測相關的血糖(血糖值、果糖胺值)、血脂(超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量)指標。實驗結(jié)果表明九州蟲草水提物可以顯著降低斑馬魚血糖和血脂值,且呈現(xiàn)劑量依賴關系。表型觀察研究基礎上,對三種狀態(tài)下的斑馬魚(正常組、10 mg/L給藥組和高糖組)進行了轉(zhuǎn)錄組測序研究,從基因?qū)用嫔钊敕治龌疾∨c健康狀態(tài)下對應基因表達量的改變。正常組與1 0 mg/L給藥組,正常組與高糖組的轉(zhuǎn)錄組DEGs數(shù)量較大,分別有6300、6521個基因表達上調(diào),4632、5768個基因表達下調(diào)。10 mg/L給藥組與高糖組的DEGs數(shù)量較前兩組少,分別有941個基因上調(diào)和1 673個基因下調(diào),表明高血糖癥斑馬魚給藥處理后雖然血糖值恢復正常,但體內(nèi)長期高糖水平對相關基因造成的改變并不能在短時間內(nèi)恢復。結(jié)合實際情況,糖尿病患者在控制血糖穩(wěn)定后仍會有一系列已發(fā)生的并發(fā)癥難以治愈,這正是糖尿病作為一種綜合性代謝疾病的困擾之處,表明了治療的長期性與困難性。考慮到體內(nèi)長期的高糖水平可能已經(jīng)改變了細胞內(nèi)某些基因和通路的表達,高糖水平下對自噬表達的改變在不同的靶細胞中仍無定論,本次對正常組、給藥組和高糖組的糖代謝相關基因(ins,pck1,pdx1,gck,g6pcaa.2)和自噬相關基因(atg3,atg4b,atg5.foxo3)進行了檢測分析,結(jié)果表明高濃度的糖對斑馬魚體細胞自噬水平呈現(xiàn)抑制作用,給藥處理后的斑馬魚細胞自噬能力有所恢復,但仍舊弱于正常組斑馬魚。這為下一步的工作提供了啟示:長期給藥處理高糖組斑馬魚,在血糖持續(xù)穩(wěn)定的前提下,觀察檢測其相關基因的表達是否恢復至正常水平,進而探討糖尿病及其并發(fā)癥的致病機理和治療效果。綜上所述,本論文應用微生物組學技術從基因和蛋白質(zhì)層面對九州蟲草的完整發(fā)育周期進行了全面的解析,隨后將傳統(tǒng)中藥的整體辨析理論對應于微觀表現(xiàn),即“九州蟲草多種活性物質(zhì)作用于多個靶點形成復雜網(wǎng)絡”,應用系統(tǒng)藥理學預測分析其藥理活性,同時結(jié)合斑馬魚模型對降血糖、降血脂進行了表觀和分子水平的研究。揭示了現(xiàn)代生物技術和分析手段在我國傳統(tǒng)中藥發(fā)展中的新型應用,增加了傳統(tǒng)中藥應用的理論基礎,為老藥新用、新藥開發(fā)以及治療人類復雜疾病提供了新的思路。
【圖文】：

頂端略變尖，干后變褐色，（２０？３０）邋ｍｍｘ邋（５？７．５）邋ｍｍ。子囊殼半逡逑埋生卵形，（３００？５２０）邋ｍｍｘ邋（２００？３００）邋ｍｍ。子囊寬３（ｘｍ？４．５邋ｐｍ柱狀。逡逑次生子囊孢子（４．５？７）邋（ｉｍｘ邋（０．６？１）邋ｐｍ柱狀（圖１－１）。逡逑＇．Ｉ．逡逑圖１－１九州蟲草（大米培養(yǎng)基上）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ邋ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｉｓ邋Ｋｏｂ邋ｏｎ邋ｒｉｃｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑１．２蟲草活性成分及藥理學研究逡逑自古以來人們用傳統(tǒng)中醫(yī)理論的“陰陽平衡”來解釋蟲草的藥效，隨著醫(yī)療逡逑水平的提高，蟲草類真菌被證明對現(xiàn)代的許多疾病也有良好的治療作用，但對逡逑于其活性成分、藥理藥效及作用機制的研宄卻不甚清晰。根據(jù)已有的研究，以逡逑下是蟲草被報道的有效成分。逡逑１．２．１蟲草素、噴司他訂及其它核苷類物質(zhì)逡逑作為一類重要的藥用成分，核苷類物質(zhì)在蟲草中至少被檢測到８種。蟲草逡逑中含有蟲草素、腺苷、噴司他汀、鳥苷、尿苷、尿嘧啶，，鳥嘧啶，胸腺嘧啶和逡逑３逡逑

一個靶點蛋白產(chǎn)生作用，而是作用于多重疾病通路的多種靶點蛋白［６８，６９］，疾逡逑病與體內(nèi)的多種基因和蛋白質(zhì)相互關聯(lián)作用，這成為新藥研發(fā)的思路之一，甚逡逑至可以治愈使用西方療法難以治愈的疾�。郏罚�，７１］（圖１－４）。逡逑７逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285;R284

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳暢,陳望化,李彥,馮濤,孫迎節(jié),張長鎧;蒙山九州蟲草與冬蟲夏草紅外光譜的比較[J];山東中醫(yī)雜志;2004年02期

2 郭英蘭,李春燕;中國一新記錄種──九州蟲草[J];菌物系統(tǒng);2000年02期

3 陳暢 ,李彥 ,羅珊珊 ,孫迎節(jié) ,張長鎧;蒙山九州蟲草對果蠅壽命的影響[J];上海中醫(yī)藥雜志;2005年02期

4 陳暢,羅珊珊,馮濤,孫迎節(jié),張長鎧;蒙山九州蟲草和冬蟲夏草核磁共振圖譜比較[J];山東中醫(yī)雜志;2004年06期

5 羅珊珊;凌建亞;陳暢;馬小清;張長鎧;;蒙山九州蟲草中黃酮類化合物提取、鑒定和含量分析[J];中國生化藥物雜志;2005年06期

6 凌建亞,張長鎧,孫迎節(jié),呂鵬,薛久剛,王延兵;毛細管區(qū)帶電泳檢測九州蟲草核苷類成分[J];分析化學;2003年01期

7 張海英;;比色法測定蒙山九州蟲草中甘露醇的含量[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2007年27期

8 羅珊珊,陳暢,史艷秋,孫迎節(jié),張長鎧;九州蟲草中核苷類成分的HPLC法測定[J];中草藥;2005年10期

9 羅毅;程顯好;朱林;金鑫;;九州蟲草的研究進展[J];中國食用菌;2009年03期

10 張海英;凌建亞;張長鎧;;九州蟲草與冬蟲夏草、蛹蟲草氨基酸成分比較[J];德州學院學報(自然科學版);2005年06期

相關會議論文 前1條

1 趙璇;凌建亞;;蟲草素抗腫瘤活性作用及九州蟲草轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組分析（英文）[A];中國菌物學會2018年學術年會論文匯編[C];2018年

相關博士學位論文 前1條

1 趙璇;九州蟲草微生物組學分析及基于系統(tǒng)藥理學的生物活性初步研究[D];山東大學;2019年

相關碩士學位論文 前8條

1 李夢竹;九州蟲草子實體多糖對日本囊對蝦感染W(wǎng)SSV及其免疫調(diào)節(jié)的影響[D];山東大學;2016年

2 趙品蒼;泰山蟲草多基因分子系統(tǒng)學研究[D];曲阜師范大學;2012年

3 羅珊珊;九州蟲草中主要藥用成分的分離和生物學活性研究[D];山東大學;2006年

4 張曉麗;原生質(zhì)體誘變技術在九州蟲草優(yōu)良菌株選育中的應用[D];山東大學;2011年

5 王延明;九州蟲草基因組改組育種與體外抗氧化活性研究[D];山東大學;2013年

6 王波;泰山蟲草資源多基因分子系統(tǒng)學研究[D];曲阜師范大學;2009年

7 杜華東;九州蟲草培養(yǎng)條件優(yōu)化及其體外抗氧化抗癌活性研究[D];福州大學;2011年

8 張海英;蒙山九州蟲草的化學成分和生物活性物質(zhì)的研究[D];山東大學;2006年

本文編號：2669743