【摘要】：研究背景:組蛋白乙酰化調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理功能,參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重建,在表觀遺傳調(diào)控中占有重要地位。組蛋白的乙�；c去乙�；^(guò)程由功能相互拮抗的組蛋白乙�；�(Histone Acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙�；�(Histone Deacetylase,HDAC)共同調(diào)控。目前,哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)18種HDAC亞型,在細(xì)胞的生命歷程中發(fā)揮著重要作用,與腫瘤、艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Anti-Retroviral Therapy,HAART)是目前AIDS臨床治療的主要方法,但HARRT只能清除血液中的病毒,卻無(wú)法清除體內(nèi)存在的病毒潛伏庫(kù)(Reservoir)。通過(guò)藥物激活潛伏病毒以徹底清除HIV,是目前AIDS治療研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的基于HDAC抑制劑(HDAC inhibitor,HDACi)的潛伏病毒活化劑有丙戊酸(Valproic acid,VPA)、伏立諾他(Suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA)、曲古抑菌素 A(TrichostatinA,TSA)等,能有效激活HIV的表達(dá)。在我國(guó),中藥和中藥復(fù)方被廣泛應(yīng)用于AIDS的治療和輔助治療。對(duì)天然來(lái)源的小分子化合物進(jìn)行HDAC抑制活性篩選,有可能發(fā)現(xiàn)具有活化潛伏HIV-1、促進(jìn)病毒庫(kù)清除的高效HDACi。研究目的:本課題組前期發(fā)現(xiàn)廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所研發(fā)的用于治療HIV/AIDS的中藥復(fù)方艾可清2號(hào)具有HDAC抑制活性。本研究的目的在于通過(guò)對(duì)屬于艾可清2號(hào)組方中藥的單體成分進(jìn)行HDAC抑制活性評(píng)價(jià),以確定艾可清2號(hào)中抑制HDAC的活性成分。同時(shí)對(duì)其他來(lái)源的中藥單體成分也進(jìn)行了 HDAC抑制活性篩選,以期發(fā)現(xiàn)高效的HDAC抑制劑。研究方法:1.采用HDAC抑制劑篩選試劑盒對(duì)艾可清2號(hào)含有的59個(gè)化合物(其中17個(gè)成分在口服艾可清2號(hào)后可在血中檢出)、從箭葉淫羊藿中分離到的12個(gè)黃酮苷類化合物、以及其他中藥來(lái)源的83個(gè)化合物進(jìn)行HDAC抑制活性篩選;2.對(duì)前期篩選出HDAC抑制活性較好的化合物,采用HDAC3/8抑制劑篩選試劑盒對(duì)其HDAC3/8抑制活性作進(jìn)一步評(píng)價(jià);3.選擇HDAC抑制活性較好的十個(gè)單體化合物,以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為模型,Western Blot法檢測(cè)藥物作用24h是否影響細(xì)胞內(nèi)HDAC蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:1.采用HDAC抑制劑篩選試劑盒對(duì)154個(gè)不同來(lái)源的化合物進(jìn)行HDAC抑制活性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100μM濃度時(shí),(1)艾可清2號(hào)含有的單體成分中以異甘草素(艾可清2號(hào)口服入血成分)和丹酚酸C對(duì)HDAC活性的抑制效果最好,抑制率分別為52.7%和51.0%;其他來(lái)源的73個(gè)化合物中以血根堿(博落回來(lái)源)和胡椒堿(胡椒來(lái)源)抑制效果最好,抑制率都為53.1%;其余化合物對(duì)HDAC活性抑制作用較弱(抑制率50%)或未檢測(cè)到抑制活性。(2)箭葉淫羊藿黃酮苷成分中有3個(gè)顯示了一定的HDAC抑制活性,但抑制率不強(qiáng)(20%抑制率50%),分別為山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(38.7%),山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷(31.3%),山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(26.5%)。2.采用HDAC3/8抑制劑篩選試劑盒對(duì)十一個(gè)化合物進(jìn)行了 HDAC3/8抑制活性評(píng)價(jià)。這些化合物分別是異甘草素、異甘草苷、丹酚酸A、丹酚酸C(艾可清2號(hào)來(lái)源),血根堿、胡椒堿、姜黃素、異槲皮苷(其他來(lái)源),山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(箭葉淫羊藿來(lái)源)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100μM濃度時(shí),(1)艾可清2號(hào)的口服入血成分異甘草苷和異甘草素對(duì)HDAC3活性抑制作用最強(qiáng),抑制率分別為99.5%和98.3%。異甘草苷和異甘草素對(duì)HDAC8活性的抑制作用也最強(qiáng),抑制率分別為63.0%,68.6%。(2)異槲皮苷和血根堿對(duì)HDAC3的抑制率分別為76.0%和56.4%,對(duì)HDAC8的抑制率分別為47.3%和46.2%;(3)山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的HDAC3抑制活性,抑制率分別為77.8%、60.6%和53.2%;但它們對(duì)HDAC8的抑制率都小于50%。(4)丹酚酸A對(duì)HDAC3和HDAC8的抑制率分別為43.5%和52.7%。(5)胡椒堿、丹酚酸C和姜黃素未檢測(cè)到對(duì)HDAC3/8有明顯抑制作用。3.Western Blot法檢測(cè)了十個(gè)篩選出的化合物在其無(wú)/低細(xì)胞毒性濃度下作用24h,對(duì) HeLa細(xì)胞內(nèi) Ⅰ 類(HDAC1～3 和 HDAC8),Ⅱ 類(HDAC4～7和HDAC9、10)和Ⅳ類HDAC(HDAC11)表達(dá)的影響。這些化合物分別是:艾可清2號(hào)成分異甘草素、異甘草苷、丹酚酸A和丹酚酸C;其他來(lái)源成分血根堿、胡椒堿和異槲皮苷;箭葉淫羊藿成分山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。結(jié)果發(fā)現(xiàn),(1)異甘草素(25、50μM)能劑量依賴性減少HDAC4、HDAC7、HDAC10的表達(dá),一定程度減少HDAC3、HDAC8,HDAC11的表達(dá);異甘草苷(50、100μM)能明顯減少 HDAC3 和 HDAC5、HDAC7、HDAC9、HDAC10,HDAC11 的表達(dá)。(2)丹酚酸A(50、100μM)能劑量依賴性減少HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10 和 HDAC11 的表達(dá);丹酚酸 C(50、100μM)能在一定程度上減少HDAC5、HDAC10和HDAC11的表達(dá)。(3)血根堿(3、4μM)能劑量依賴性抑制HDAC1、HDAC3、HDAC8(Ⅰ類),HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9(Ⅱ類)的表達(dá)。(4)胡椒堿(100μM)能減少HDAC6和HDAC11的表達(dá)。(5)異槲皮苷(100μM)能明顯減少HDAC8,HDAC11的表達(dá)。(6)山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(50、100μM)能明顯抑制HDAC6、HDAC10的表達(dá);山奈酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷能抑制HDAC7,HDAC11的表達(dá),在100μM時(shí)能一定程度抑制 HDAC4,HDAC5 和 HDAC9 的表達(dá)。結(jié)論:1.本研究發(fā)現(xiàn)艾可清2號(hào)口服入血成分異甘草素和異甘草苷既能顯著抑制HDAC3/8活性,還能顯著抑制HeLa細(xì)胞中HDAC蛋白的表達(dá)。異甘草素和異甘草苷應(yīng)屬于艾可清2號(hào)的有效成分,并可能在體內(nèi)通過(guò)抑制HDAC活性發(fā)揮作用。這兩個(gè)化合物是否能激活潛伏HIV還需要進(jìn)行研究。2.本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)艾可清2號(hào)組方成分丹酚酸A和丹酚酸C(口服尚未在血中檢出),箭葉淫羊藿中的黃酮苷化合物,以及其他來(lái)源的單體成分血根堿等對(duì)HDAC蛋白的活性及蛋白的表達(dá)也都具有良好的抑制作用。值得進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖１－１邋ＨＤＡＣ活性抑制率（％）逡逑三、箭葉淫羊蕾中ｈｄａｃ抑制活性成分的篩選邐，逡逑本課題組前期研究己發(fā)現(xiàn)［９６］：中藥復(fù)方艾可清２號(hào)具有一定ＨＤＡＣ抑制活桂。逡逑

本試驗(yàn)中溶劑ＤＭＳＯ的最大濃度為０．５％，此時(shí)對(duì)ＨＤＡＣ３的抑制率為５．７％。陽(yáng)逡逑性對(duì)照ＴＳＡ在１．２５ｐＭ巧表現(xiàn)出了很強(qiáng)的ＨＤＡＣ３抑制活化抑制率達(dá)％．５％，，接近逡逑５0ｎＭ時(shí)ＳＡＨＡ的抑制效果（圖１－２）。１１個(gè)被測(cè)試的樣品中活性最強(qiáng)的異甘草昔和逡逑異甘草素為艾可清２號(hào)組方的入血成分，在ｌＯＯｐＭ濃度時(shí)對(duì)ＨＤＡＣ３的抑制率分別為逡逑９９．５％巧９８．３％，接近５０＾ｉＭ邋ＳＡＨＡ的抑制效果；在５（ＨｉＭ濃度時(shí)兩者對(duì)ＨＤＡＣ３的抑逡逑制率也巧超過(guò)了邋６０％；其次是山奈酷－３－０－0１壬－化喃阿拉伯糖昔（９－２）和異懈皮昔，逡逑在濃度時(shí)對(duì)ＨＤＡ口的抑制率超過(guò)７０％；血根堿，山奈酌－Ｓ－Ｏ－ｐ－Ｄ－Ｉ化喃木糖逡逑巧（９－３）和山奈酷－３－０－Ｐ－Ｄ－脅睛葡萄糖巧（２０－２）在ｌＯＯｐＭ濃度時(shí)也表現(xiàn)出了良好逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2668619