【摘要】：第一部分去甲斑蝥素調(diào)控β-catenin/miR-301a/ZBTB4信號通路抑制三陰性乳腺癌細胞遷移和侵襲的研究目的:研究顯示,miR-301a可促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。但miR-301a在三陰性乳腺癌中的功能及其機制尚不明確。本課題旨在研究:miR-301a對三陰性乳腺癌細胞遷移和侵襲的作用;miR-301a的下游靶基因調(diào)控機制;去甲斑蝥素通過調(diào)控miR-301a對三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法:利用生物信息學(xué)技術(shù)分析miR-301a的表達水平;通過定量PCR驗證miR-301a在乳腺癌組織中的表達水平;使用transwell實驗研究miR-301a對三陰性乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;通過免疫印跡、免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達水平;利用雙熒光素酶報告基因驗證miR-301a下游靶基因;使用BALB/c標(biāo)準(zhǔn)小鼠建立肺轉(zhuǎn)移模型進行動物實驗。結(jié)果:本課題實驗結(jié)果顯示,通過分析癌癥基因組圖譜的高通量測序數(shù)據(jù),miR-301a在三陰性乳腺癌中異常高表達。miR-301a類似物可促進三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲,而miR-301a抑制物可削弱三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。通過雙熒光素酶報告基因確定ZBTB4為miR-301a的下游靶基因,且過表達ZBTB4可減弱miR-301a對三陰性乳腺癌的作用。敲低β-catenin后miR-301a表達水平降低,ZBTB4表達水平升高,但過表達miR-301a和ZBTB4對β-catenin的表達水平?jīng)]有影響。此外,去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)通過Wnt/β-catenin信號通路抑制miR-301a,上調(diào)ZBTB4表達水平,抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲,并減少小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。結(jié)論:本課題研究表明,miR-301a通過靶向ZBTB4在三陰性乳腺癌中發(fā)揮致癌作用;去甲斑蝥素可通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控miR-301a,抑制三陰性乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。第二部分去甲斑蝥素調(diào)控Akt和ERK信號通路誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細胞衰老和周期停滯的研究目的:Akt和ERK信號通路的激活與乳腺癌的進展密切相關(guān),抑制Akt或ERK信號可導(dǎo)致細胞衰老。然而,細胞衰老過程中Akt和ERK信號通路間的相互作用以及如何同時抑制三陰性乳腺癌中的Akt和ERK信號傳導(dǎo)尚未闡明。本課題旨在驗證去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)對細胞周期和細胞衰老的影響,并探討其在三陰性乳腺癌中與Akt和ERK信號通路的關(guān)系。方法:使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力和細胞增殖率;通過流式細胞術(shù)分析細胞周期和細胞凋亡;利用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測細胞衰老;通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)技術(shù)測量蛋白水平;使用NF-κB報告基因檢測熒光素酶活性;通過裸鼠皮下成瘤進行動物實驗。結(jié)果:本課題實驗結(jié)果顯示,NCTD可在體外有效誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細胞周期停滯和細胞衰老,同時伴隨磷酸化Akt和ERK1/2的下降以及p21和p16的上升;聯(lián)合使用信號通路抑制劑LY294002和U0126可獲得類似NCTD的效果;NCTD通過下調(diào)磷酸化Akt和ERK1/2以及上調(diào)p21抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。此外,NCTD以NF-κB非依賴的方式上調(diào)衰老相關(guān)分泌表型可溶性信號傳導(dǎo)因子的表達水平。結(jié)論:本課題研究結(jié)果表明,NCTD主要通過同時阻斷三陰性乳腺癌中Akt和ERK信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)細胞衰老和細胞周期停滯,提示NCTD可能是三陰性乳腺癌潛在的輔助治療手段,其上調(diào)衰老相關(guān)分泌表型相關(guān)因子的機制仍需進一步研究。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文6 *表示 p <0.05，**表示 p <0.01。 結(jié)果.1 miR-301a 在乳腺癌中的表達情況研究顯示，miRNA 在惡性腫瘤中異常表達，導(dǎo)致下游靶基因的表達和功能以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，課題組首先研究了 miRNA 在乳腺癌中的表達情.1.1 miR-301a 在乳腺癌中異常高表達課題組利用腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的測序數(shù)析了 miRNA 在 103 例乳腺癌組織及配對癌旁組織中的表達情況。結(jié)果顯示iR-301a 在乳腺癌中的表達明顯升高。（圖 1.1.1）

miR-301aexpressionlevelnon-TNBC TNBC02468(n=746) (n=151)**圖 1.1.2 miR-301a 在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的表達情況e 1.1.2 Expression of miR-301a in triple-negative breast cancer and non-triple nbreast cancermiR-301a 在乳腺癌臨床樣本中的表達情況進一步驗證 miR-301a 的表達情況，，課題組通過定量 PCR 檢測了 m醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺癌臨床樣本中的表達水平。結(jié)果顯示，m癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，且 miR-301a 在 TNBC 組織明顯高于非 TNBC 組織。（圖 1.1.3）
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2668472