【摘要】：研究目的:虎眼萬年青具有顯著的抗腫瘤活性,其皂苷類化合物是主要有效成分之一,本實驗目的在于研究虎眼萬年青鱗莖和葉各自總皂苷對結(jié)腸癌的抗癌活性,觀察其對結(jié)腸癌細胞凋亡、自噬的影響,以初步探討抗結(jié)腸癌的作用機理以及尋找發(fā)現(xiàn)新的有效藥用部位。方法:1.結(jié)腸癌裸鼠模型的制備、標本收集與相關指標測定;藥物虎眼萬年青總皂苷(OCA-TS)的提取。(1)制備模型、收集標本:每只裸鼠腋窩皮下接種為1×10~7/0.1ml混懸腫瘤細胞0.1ml。當裸鼠腫瘤體積達到100 mm~3時,認為荷瘤成功,將荷瘤裸鼠隨機分為5組:模型組、陽性藥組、OCA-TS組。根據(jù)分組分別進行藥物灌胃處理,每天1次。藥物處理7d后處死各組荷瘤裸鼠,收集各組裸鼠血清樣本;取腫瘤組織及癌旁組織。腫瘤組織和癌旁組織部分10%中性甲醛溶液固定,部分液氮速凍轉(zhuǎn)至-80℃保存?zhèn)溆谩?2)用HE染色觀察虎眼萬年青總皂苷對腫瘤組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)的影響;Western blot法檢測腫瘤組織中ATG5、LC3 II/I、Beclin1、VDAC1的表達量;免疫組化法檢測VDAC1表達(3)采用乙醇熱回流法提取虎眼萬年青鱗莖和葉中各自總皂苷(TS)成分。2.虎眼萬年青總皂苷對結(jié)腸癌細胞系生長增殖、凋亡與自噬影響的檢測:(1)細胞形態(tài)學檢測:MTT比色法檢測OCA-TS鱗莖和葉分別對結(jié)腸癌細胞增殖的影響;平板克隆形成實驗(PCF)檢測OCA-TS對結(jié)腸癌細胞Lo Vo的克隆形成能力;Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測OCA-TS對人結(jié)腸癌細胞系凋亡與周期的影響。(2)Western Blotting法檢測OCA-TS作用人結(jié)腸癌細胞后凋亡及自噬相關蛋白的表達情況;透射電鏡下觀察OCA-TS對人結(jié)腸癌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響以及觀察自噬溶酶體的形成;用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒追蹤OCA-TS作用人結(jié)腸癌細胞后產(chǎn)生的自噬流的變化結(jié)果:1.OCA-TS組用0.1g/kg、1 g/kg、10g/kg每日灌胃給藥1次,各組連續(xù)給藥7天,對裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長均具有抑制作用,10g/kgOCA-TS組腫瘤體積抑制率已接近陽性藥組的54.95%;HE染色結(jié)果顯示給藥組細胞細胞核分裂明顯減少,活躍度降低;Western-blotting結(jié)果顯示:各組用藥小鼠腫瘤組織中均有ATG5、LC3II/I、Beclin1等自噬相關蛋白的表達,且呈上調(diào)趨勢;免疫組化結(jié)果,用藥組VDAC-1蛋白陽性表達呈現(xiàn)染色棕黃色、棕褐色顆粒。2.(1)MTT結(jié)果顯示虎眼萬年青鱗莖和葉分別提取出的OCA-TS均能夠抑制四種結(jié)腸癌細胞的增殖,并呈現(xiàn)出時間濃度的依賴,OCA-TS葉作用48h,IC_(50)分別為:RKO,1.28mg/ml;Caco-2,0.96mg/ml;HCT116,0.96mg/ml;LoVo,0.96mg/ml;OCA-TS鱗莖作用48h,IC_(50)分別為:RKO,1.17mg/ml;Caco-2,1.00mg/ml;HCT116,0.97mg/ml;LoVo,0.64mg/ml。OCA-TS鱗莖作用活性稍高于葉,Lo Vo細胞對藥物作用更為敏感。LoVo細胞在OCA—TS作用以后,各組細胞克隆形成率明顯下降,與MTT結(jié)果一致,也具有濃度依賴性。(2)OCA-TS誘導Lo Vo細胞凋亡,尤其早期凋亡明顯,1mg/mlOCA-TS用藥組,總凋亡率接近50%(P0.01);檢測凋亡相關蛋白表達得到,藥物作用后的LoVo細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降明顯,而促凋亡蛋白Bax表達則上調(diào)。(3)OCA-TS使Lo Vo細胞周期阻滯于G_1期。(4)電鏡下觀察到在1mg/mlOCA-TS用藥組自噬溶酶體和自噬空泡的形成;LC3B腺病毒感染用藥細胞后觀察到自噬流的形成。結(jié)論:1.OCA-TS能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移模型動物體內(nèi)的腫瘤生長2.細胞水平上,OCA-TS鱗莖和葉對結(jié)腸癌細胞系RKO細胞、Caco-2細胞、HCT116細胞以及LoVo細胞均具有明顯的抑制細胞增殖的作用,說明虎眼萬年青鱗莖和葉總皂苷提取物均具有抗腫瘤活性。四種結(jié)腸癌細胞對OCA-TS的作用存在敏感性差異,其中Lo Vo細胞對不同濃度的OCA-TS反應更為敏感。3.OCA-TS能夠誘導LoVo細胞凋亡,調(diào)控Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax等的綜合表達可能是其抗癌作用的可能機制之一4.OCA-TS對結(jié)腸癌體內(nèi)體外都具有的抗癌活性,還可能與其都夠誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生自噬有關。
【圖文】：

圖 1 裸鼠種植瘤體積（A：模型組；B：陽性藥組；C：0.1 g/kgOCA-TS 組；D：1g/kgOCA-TS 組；E：10 g/kgOCA-TS 組 **P<0.01，與模型組比較）2. 對腫瘤組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)的影響HE 染色后顯微鏡下觀察，可見與模型組相比，陽性藥組、OCA-TS 組腫瘤細胞數(shù)目明顯減少，細胞核染色較淺，細胞核漿比例減小，核分裂相對減少，說明癌細胞活躍程度均有不同程度降低；10g/kgOCA-TS 組細胞胞漿還出現(xiàn)透明空泡；對照組腫瘤細胞排列密集，細胞異型性明顯，核大深染，細胞核質(zhì)比例明顯增大，畸形核和核分裂相多見，細胞更活躍，見圖 2。A B C D E0200腫瘤

圖 3：腫瘤組織中 ATG5、LC3 II/I、Beclin1 蛋白的條帶以及相對表達量的結(jié)果（A：模型組；B：陽性藥組；C：0.1 g/kgOCA-TS 組；D：1 g/kgOCA-TS 組；E：10 g/kgOCA-TS組 各組與模型組相比，P<0.01，，均有顯著性差異）4. 免疫組化、Western blot 法檢測腫瘤組織中 VDAC1 表達的結(jié)果VDAC1 主要分布在結(jié)腸癌瘤組織的細胞漿中，陽性染色呈現(xiàn)棕黃色、棕褐色顆粒。各治療組腫瘤的 VDAC1 表達均高于模型組, 見圖 4； 統(tǒng)計分析結(jié)果表明存在著顯著性差異。統(tǒng)計結(jié)果詳見表 1。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 曹海玲;徐f

本文編號：2668023