【摘要】：背景和目的:銀杏葉提取物(EGb761)是我國傳統(tǒng)中藥材銀杏葉的一種標(biāo)準(zhǔn)提取物。最近,大量研究表明EGb761具有廣泛的抗腫瘤的作用。然而,EGb761對胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的具體作用及其機(jī)制還不明了。本研究旨在探討EGb761對人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制,為探索更理想胃癌治療方案提供理論依據(jù)。方法:1.體外細(xì)胞實驗:體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞,待細(xì)胞長到對數(shù)生長期,采用0μg/m L,200μg/m L,400μg/m L,600μg/m L的EGb761處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24小時,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白。用Western Blot法檢測不同濃度EGb761對胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)的影響。此外,采用特異性的ERK1/2抑制劑U0126(10μM)預(yù)處理細(xì)胞2小時后,再加入400μg/m L的EGb761處理SGC-7901細(xì)胞24小時;采用Transwell侵襲試驗和劃痕試驗分別檢測EGb761和(或)U0126對細(xì)胞侵襲和遷移的影響;并采用Western Blot法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB P65、NF-κB p-P65、MMP2的蛋白表達(dá)。2.動物實驗:建立裸鼠胃癌原位移植模型,1周后將裸鼠隨機(jī)為空白對照組和EGB761組(40mg/kg,每周2次,腹腔注射),再飼養(yǎng)4周后處死裸鼠。測量兩組裸鼠的原位腫瘤的大小,免疫組化檢測原位腫瘤中ERK、NF-κB P65、MMP2的表達(dá),HE染色確定裸鼠肝轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果:1.不同濃度的EGb761處理細(xì)胞后,0μg/m L組,200μg/m L組,400μg/m L組,600μg/m L組的ERK1/2的相對蛋白表達(dá)量分別是:0.826±0.051、0.730±0.045、0.436±0.041和0.236±0.030;對應(yīng)的p-ERK1/2的相對蛋白表達(dá)量分別是0.746±0.025、0.676±0.046、0.383±0.041和0.193±0.032。表明EGb761可抑制ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達(dá),并呈一定的劑量依賴的關(guān)系。Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示空白組、U0126組、EGb761組和EGb761+U0126組侵襲細(xì)胞數(shù)(個)分別為:126.33±15.27、77.00±11.00、68.00±8.54和29.33±7.50;劃痕試驗結(jié)果顯示空白組、U0126組、EGb761組和EGb761+U0126組的劃痕愈合率(%)分別是74.10±4.65、32.30±2.48、30.76±6.19和16.06±2.91。以上數(shù)據(jù)表明EGb761及U0126皆可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的侵襲和遷移,聯(lián)合使用EGb761與U0126能更有效地抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。Western Blot結(jié)果示,空白組、U0126組、EGb761組和EGb761+U0126組的ERK1/2的相對蛋白表達(dá)量分別是0.720±0.040、0.710±0.062、0.406±0.032、0.446±0.047;對應(yīng)的p-ERK1/2的相對蛋白表達(dá)量分別是0.803±0.040、0.363±0.045、0.430±0.040、0.150±0.026;對應(yīng)的NF-κB P65的相對蛋白表達(dá)量分別是0.820±0.087、0.636±0.041、0.643±0.041、0.313±0.047;對應(yīng)的NF-κB p-P65的相對蛋白表達(dá)量分別是0.633±0.032、0.506±0.051、0.483±0.041、0.180±0.036;對應(yīng)的MMP2的相對蛋白表達(dá)量分別是0.493±0.032、0.376±0.066、0.360±0.026、0.130±0.036。以上數(shù)據(jù)表明,EGb761能抑制ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB P65、NF-κB p-P65、MMP2蛋白的表達(dá),與U0126聯(lián)合使用能更顯著地抑制ERK、NF-κB通路和MMP2蛋白的表達(dá)。2.空白組和EGb761組裸鼠原位腫瘤的大小(mm3)分別是317.48±151.32、63.89±53.92;空白組5只裸鼠中3只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,EGb761組5只裸鼠中0只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。原位腫瘤組織免疫組化結(jié)果示:空白組和EGb761組ERK1/2陽性的細(xì)胞比例(%)分別是75.80±5.89、15.40±3.43;對應(yīng)的NF-κB P65的陽性細(xì)胞比例(%)分別是84.00±4.74、13.80±4.14;對應(yīng)的MMP2陽性的細(xì)胞比例(%)分別是71.00±4.24、11.20±3.56。綜上,EGb761通過抑制ERK、NF-κB通路和MMP2的表達(dá)來抑制胃癌原位腫瘤的生長,并且抑制胃癌的肝臟轉(zhuǎn)移。結(jié)論:1.EGb761能有效抑制體內(nèi)外胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.EGb761可能通過抑制ERK/NF-κB/MMP2信號通路從而抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

胃 癌 SGC-7901 細(xì) 胞 在 不 同 濃 度 的 EGb761(0μg/mL,200μg400μg/mL, 600μg/mL）中干預(yù) 24 小時，，提取細(xì)胞蛋白。用 Western Blo檢測 ERK1/2、p-ERK1/2 的表達(dá)，用軟件統(tǒng)計分析目的蛋白條帶的灰度值GAPDH 灰度值的比值。結(jié)果表明不同濃度的 EGb761 干預(yù)胃癌細(xì)胞后200μg/mL 組、400μg/mL 組、600μg/mL 組的 ERK1/2、p-ERK1/2 的相對達(dá)量較空白對照組（0μg/mL 組）明顯降低，呈一定的劑量依賴關(guān)系，差有統(tǒng)計學(xué)意義（表 1）（圖 1）。表 1. 各實驗組 ERK1/2、p-ERK1/2 的相對蛋白表達(dá)量(n=3, x ±s)0μg/mL 組 200μg/mL 組 400μg/mL 組 600μg/mL 組ERK1/2 0.826±0.051 0.730±0.045*0.436±0.041**0.236±0.030**p-ERK1/2 0.746±0.025 0.676±0.045*0.383±0.041**0.193±0.032***P<0.05 vs 空白對照組，**P<0.01 vs 空白對照組

用 U0126（10μM）預(yù)處理 SGC-7901 細(xì)胞 2 小時后和（或）EG（400μg/mL）處理 SGC-7901 細(xì)胞 24 小時，用 Transwell 侵襲試驗測組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果表明 U0126 組和 EGb761 組侵襲細(xì)胞數(shù)較空白組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。EGb761+U0126 組較 U0126 組或 EG組能更顯著減少侵襲細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表 2）（圖 2）。表 2.各實驗組的侵襲細(xì)胞數(shù)(n=3, x ±s)組別 侵襲細(xì)胞數(shù)（個）空白組 126.33±15.27EGb761 組 77.00±11.00** ##U0126 組 68.00±8.54** ##EGb761+U0126 組 29.33±7.50****P<0.01 vs 空白對照組；##P<0.01 vs EGB761+U0126 組
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2667851