【摘要】：目的:以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),在功效、證候背景下,通過傳統(tǒng)中醫(yī)藥文獻挖掘與現(xiàn)代藥理、毒理學(xué)研究相結(jié)合的手段,在柴胡具有疏肝解郁功效和抗肝纖維化作用的基礎(chǔ)上,建立適宜于中藥病證背景下評價活性的肝郁脾虛型肝纖維化大鼠模型,運用體內(nèi)、外研究手段在整體、細胞水平上開展柴胡不同樣品的藥效活性研究,明確柴胡對肝郁脾虛行肝纖維化的藥效作用并探討其初步藥效機制,進行藥效伴隨毒副作用研究,揭示其受累靶器官和毒副作用特點,驗證不同樣品對病證模型的活性作用,為明確柴胡藥效、毒性物質(zhì)基礎(chǔ)進行證候背景下的“效—毒”關(guān)聯(lián)評價,為肝纖維化的中醫(yī)治療提供新的用藥依據(jù)和策略。方法:通過給予注射豬血清誘導(dǎo),外加不同酒精濃度及高脂低蛋白飼料喂養(yǎng),多因素構(gòu)建適宜肝郁脾虛證評價的肝纖維化動物模型;優(yōu)化并建立肝郁脾虛型肝纖維化大鼠模型,實驗期間觀察大鼠一般情況,并使用中醫(yī)肝郁脾虛證證候積分進行評價,觀察柴胡水提物和柴胡總皂苷對模型大鼠的抑制作用;檢測血清中ALT、AST、LN、HA、PC-III、IV-C、TGF-β1、BUN、Cr指標(biāo)的變化,并進行肝組織馬松染色分析肝臟纖維化病變程度,明確柴胡不同組分對模型大鼠的伴隨毒性;體外通過培養(yǎng)HSC-T6細胞和L-02細胞,運用MTT實驗、觀察細胞形態(tài)學(xué)變化,考察柴胡不同組分對HSC-T6細胞和L-02細胞的影響,并檢測細胞上清液LDH、GSH和GSH-Px的含量來進一步探究柴胡不同組分體外產(chǎn)生“效—毒”的作用劑量,明晰安全劑量范圍。結(jié)果:在造模3周后,各模型組的大鼠均達到明顯肝纖維化損傷程度,且大鼠主證、次證均符合肝郁脾虛證的證候表現(xiàn)。與正常對照組比較,血清ALT、AST、TGF-β1水平顯著升高,肝纖維化四項LN、HA、PC-III、IV-C的水平均明顯升高;病理切片可見肝細胞纖維隔形成,達到明顯肝纖維化程度;且動物無死亡現(xiàn)象。成模后連續(xù)給予0.90~3.60 g·kg~(-1)柴胡水提物和7.04~13.90mg·kg~(-1)柴胡總皂苷的可改善大鼠飲食、飲水和活動情況,明顯降低肝纖維化大鼠血中HA、LN、IV-C、PCIII等指標(biāo)含量和肝臟系數(shù),病理組織學(xué)改變減輕。但藥物高劑量組血中ALT、AST、BUN、Cr水平升高。體外給予肝星狀HSC-T6細胞和肝正常L-02細胞不同劑量的柴胡水提物和柴胡總皂苷,柴胡水提物對HSC-T6細胞的半數(shù)抑制濃度(IC_(50))為6.23mg·mL~(-1),對L-02細胞的TC_(50)為10.70mg·mL~(-1);柴胡總皂苷對HSC-T6細胞的IC50為3.52mg·mL~(-1),對L-02細胞的TC_(50)為6.68mg·mL~(-1)。檢測給藥后細胞的上清,給藥24h后發(fā)現(xiàn)LDH活性隨給藥濃度的上升而升高,與劑量呈現(xiàn)正相關(guān);而細胞上清液中GSH、GSH-Px的活性均隨濃度的上升而下降,與劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。結(jié)論:經(jīng)過改良高脂低蛋白飼料及酒精刺激強度后,能夠成功建立肝纖維化(肝郁脾虛證)大鼠模型,該模型證候與臨床病證吻合度較高;柴胡水提物、柴胡總皂苷均對肝郁脾虛型纖維化大鼠具有顯著的治療作用,可減輕病證程度,且量效關(guān)系良好,同時3.60 g·kg~(-1)柴胡水提物和13.90mg·kg~(-1)的柴胡總皂苷會產(chǎn)生一定的肝臟、腎臟的伴隨毒副作用。HSC-T6細胞和L-02細胞隨柴胡水提物劑量升高抑制率升高,呈現(xiàn)正相關(guān),提示柴胡水提物“效—毒”劑量安全窗范圍為6.23 mg·mL~(-1)~10.70 mg·mL~(-1),治療指數(shù)(TI)為1.72;HSC-T6細胞和L-02細胞隨柴胡總皂苷劑量升高抑制率升高,呈現(xiàn)正相關(guān),提示柴胡總皂苷“效—毒”劑量安全窗范圍為3.52 mg·mL~(-1)~6.68 mg·mL~(-1),治療指數(shù)(TI)為1.90。給藥后的HSC-T6和L-02細胞上清中均檢測到GSH、GSH-Px活力下降,并且伴隨LDH的濃度升高,提示柴胡水提物和柴胡總皂苷抑制HSC-T6和L-02細胞生長與影響細胞中自由基有關(guān)。
【圖文】：

改良高脂和酒精刺激強度對大鼠肝纖維化模型體重的影響

圖 2 改良高脂和酒精刺激強度對大鼠肝纖維化模型體重變化的影響3.1.2 日食量及日水量的變化肝郁脾虛證主要表現(xiàn)為肝臟疏泄失調(diào)、脾胃健運不暢，因而在造模過程中，
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2667339