【摘要】：膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷(ALI)/呼吸窘迫綜合征(ARDS)在重癥監(jiān)護病房較為常見,病死率高。目前研究認為,肺上皮細胞的凋亡在ALI/ARDS的發(fā)病過程中起到重要作用。因此,探究肺上皮細胞發(fā)生凋亡的分子機制,尋求有效的干預(yù)靶點,對于ALI/ARDS的治療具有重要的意義。最近研究發(fā)現(xiàn),細胞自噬現(xiàn)象,作為細胞的一種自我保護反應(yīng),適當(dāng)?shù)淖允捎兄诰S持細胞的穩(wěn)態(tài)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg1能夠通過增強細胞自噬反應(yīng),來抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞的凋亡。為進一步探明ALI/ARDS發(fā)生過程中,細胞自噬參與肺上皮細胞凋亡發(fā)生的分子機制,尋求抑制肺上皮細胞凋亡的有效靶點,本研究將針對上述問題展開,主要分為三個部分:第一部分:小鼠內(nèi)毒素致肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型的建立目的:建立LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS小鼠模型。方法:小鼠麻醉后,采用LPS氣管滴入法建立ALI/ARDS模型,在造模24小時后,采用肺功能分析系統(tǒng)檢測氣道呼吸阻力。采用RT-PCR、Western Blot等技術(shù),檢測小鼠肺組織中Caspase-3的表達情況。通過組織病理切片觀察肺組織損傷情況,確認ALI/ARDS模型的成功建立。結(jié)果:LPS氣道滴入可以導(dǎo)致小鼠急性肺損傷,造模24h后,小鼠出現(xiàn)呼吸急促等現(xiàn)象。小鼠肺功能分析系統(tǒng)檢測顯示,小鼠氣道呼吸阻力明顯上升;模型小鼠肺組織切片病理HE染色顯示,肺組織結(jié)構(gòu)炎性細胞浸潤明顯,微血管充血,肺間質(zhì)出血水腫,肺泡結(jié)構(gòu)模糊,肺泡腔大范圍消失。在ALI/ARDS模型小鼠肺組織中,Caspase-3的表達在損傷24小時后較對照組明顯升高,提示造模后存在肺上皮細胞的凋亡。結(jié)論:采用LPS滴注方法能夠成功建立ALI/ARDS小鼠模型第二部分:細胞自噬參與LPS介導(dǎo)的肺上皮細胞凋亡的分子機制研究目的:闡明細胞自噬參與LPS導(dǎo)致的肺上皮細胞的凋亡的分子機制方法:采用LPS處理肺上皮細胞,并通過CCK8、Western blot、流式細胞儀、免疫熒光等技術(shù),檢測LPS刺激肺上皮細胞后,自噬和凋亡的變化趨勢。其次,采用化學(xué)小分子抑制劑,檢測調(diào)控細胞自噬對凋亡的影響,并檢測細胞自噬的改變對Nrf2表達和NF-?b信號通路關(guān)鍵蛋白p-p65表達的影響。動物實驗部分LPS肺損傷造模后,采用Western blot等技術(shù),驗證LPS刺激對肺上皮細胞自噬和凋亡的變化及Nrf2和p-p65蛋白表達的影響。結(jié)果:LPS刺激肺上皮細胞后,隨著LPS濃度的增加,肺上皮細胞的凋亡也隨之增加,肺上皮細胞的自噬升高。在特定LPS濃度刺激下,隨著LPS作用時間的延長,肺上皮細胞的凋亡逐漸增加,而自噬先增加后降低。特定LPS濃度刺激下,在特定時間段,通過3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬可增加LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞凋亡;相反,通過雷帕霉素激活自噬可以明顯減少LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞凋亡。提示細胞自噬能夠調(diào)控LPS介導(dǎo)的肺上皮細胞的凋亡;即抑制自噬,凋亡增加;提高自噬,凋亡下降。在特定濃度LPS刺激下,隨著作用時間的延長,肺上皮細胞的自噬水平先升高后下降,保護性分子Nrf2的表達也是先升高后下降,提示Nrf2在LPS介導(dǎo)的細胞凋亡過程中可能發(fā)揮了重要的作用。靶向抑制Nrf2能夠增強p-p65的水平,導(dǎo)致肺上皮細胞凋亡增加,而對細胞自噬水平無明顯影響。結(jié)論:LPS導(dǎo)致的肺上皮細胞的凋亡具有濃度和時間依賴性。在ALI/ARDS發(fā)生過程中,細胞自噬的增強,能夠促進Nrf2蛋白的表達,導(dǎo)致炎癥通路NF-?b信號通路受阻,進而抑制肺上皮細胞的凋亡,并抑制ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展。第三部分:人參皂甙Rg1對LPS導(dǎo)致的肺損傷的保護作用機制研究目的:闡明人參皂甙Rg1對LPS導(dǎo)致的肺損傷的保護作用機制方法:運用Western blot、流式細胞等技術(shù),檢測人參皂甙Rg1作用肺上皮細胞后細胞凋亡情況,以及相關(guān)蛋白的表達情況。通過組織結(jié)構(gòu)染色,檢測Rg1處理ALI/ARDA小鼠模型后,肺組織結(jié)構(gòu)的變化情況。通過免疫組化方法檢測相關(guān)蛋白在模型小鼠肺組織的表達情況。結(jié)果:人參皂苷Rg1能夠增強肺上皮細胞的自噬水平,促進Nrf2的表達,并抑制炎性分子p-p65的表達,進而減少LPS導(dǎo)致的肺上皮細胞凋亡。同樣,在ALI/ARDA小鼠模型中,人參皂苷Rg1能夠增加細胞自噬,促進Nrf2的表達,并抑制炎性分子p-p65的表達,進而緩解LPS誘導(dǎo)的肺損傷。結(jié)論:人參皂甙Rg1通過提高肺上皮細胞的自噬,促進Nrf2的表達,抑制p65的磷酸化,從而對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷起到保護作用。
【圖文】：

小鼠及正常小鼠肺功能相關(guān)參數(shù)正常組 力（Ri） 13.22±2.54 力（Re） 8.32±1.76 （Cldyn） 0.0191±0.0022 blot，q-PCR 來檢測 caspase-3 顯示，，與正常小鼠相比，在 LPSse 表達顯著升高。同樣，采用 q-PCR S 造模小鼠的肺組織中，Caspase 3 的 m水平相一致，提示 LPS 誘導(dǎo)肺損傷能

術(shù)檢測模型小鼠肺組織中凋亡相關(guān)蛋白 Caspase 3 的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化情況片染色結(jié)果顯示，LPS 造模組小鼠肺組淋巴細胞等炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)。而對照組肺泡結(jié)構(gòu)完好，肺泡腔清晰），提示 LPS 氣管滴注能夠誘導(dǎo) ALI/A
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2665949