【摘要】：目的:觀察益氣活血解毒中藥血清(Yiqihuoxuejiedu drug serum,TCM)、腎上腺髓質素(Adrenomedullin,ADM)抑制醛固酮(Aldosterone,ALD)誘導的人近端腎小管上皮細胞(HK2)自噬的作用。方法:本實驗采取HK2細胞作為研究對象,采用1μMol/L醛固酮濃度作為自噬的誘導條件,給予10%的益氣活血解毒含藥血清、100nMol/L的腎上腺髓質素治療。實驗分組為對照組(CON),醛固酮組(ALD),醛固酮(ALD)+益氣活血解毒含藥血清(TCM),醛固酮(ALD)+腎上腺髓質素組(ADM),48小時后收集細胞并觀察變化。采用免疫細胞熒光,Western blot方法檢測血清糖皮質激素誘導蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid induced kinase,SGK-1),磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,PERK1/2),磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin,P-mTOR),自噬相關基因5(Autophagy associated gene,Atg5),酵母自噬基因6(Atg6)的同源物Beclin1,自噬標志微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表達。結果:1免疫細胞熒光檢測自噬通路中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR表達用激光共聚焦顯微鏡觀察HK2細胞中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR的表達,結果顯示ALD刺激后SGK-1表達明顯增強,主要表達于細胞漿中,與CON組相比有顯著性差異;TCM、ADM治療組表達較ALD組明顯減弱。P-ERK1/2在ALD組的表達較CON組顯著升高,胞漿及細胞核均見到表達;給以TCM、ADM干預后,表達明顯降低。P-mTOR為自噬的負調控因子,CON組呈陽性表達,以胞漿為主,而ALD組表達明顯減弱,TCM、ADM干預后較ALD組表達增強。2免疫細胞熒光檢測HK2細胞中自噬相關蛋白Atg5,Beclin1和LC3的表達結果顯示,ALD組自噬相關蛋白Atg5,Beclin1與CON相比均明顯增多,主要分布在胞漿中,TCM及ADM組較ALD組明顯減弱。CON組LC3在胞漿散在分布,而ALD誘導后,自噬體膜形成且主要與溶酶體融合,形成自噬溶酶體,自噬溶酶體在細胞質中成顆粒狀分布,TCM、ADM干預后胞漿中顆粒狀物質減少,且LC3明顯散在分布整個胞漿。3 Western blot檢測HK2細胞SGK-1,P-ERK1/2,Atg5,Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達Western blot結果顯示自噬信號通路中ALD組中SGK-1、P-ERK/ERK表達明顯高于CON組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),TCM、ADM均可抑制其表達,兩組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。檢測自噬抑制蛋白mTOR的表達,P-mTOR及總蛋白水平在ALD組均較CON組下調,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),給以TCM、ADM治療后,可以上調其表達。自噬相關蛋白Atg5,Beclin1,LC3是自噬過程中最重要的正調節(jié)因子,參與自噬體的形成,其中ALD組,Atg5,Beclin1,LC3較CON組表達增強,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),TCM、ADM組與ALD組相比明顯降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1醛固酮可誘導人近端腎小管上皮細胞發(fā)生自噬2腎上腺髓質素可通過調控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑拮抗鹽皮質激素受體復合物的活化所誘導的腎小管上皮細胞損傷,進而起到保護腎小管上皮細胞的作用3益氣活血解毒中藥可抑制人近端腎小管上皮細胞自噬,其可能的機制與下調SGK-1,P-ERK1/2的表達有關。
【圖文】：

圖 1 免疫細胞熒光法檢測 HK2 細胞中 SGK-1 的蛋白表達（oil×630）Fig1 Expression of SGK-1 in HK2 cells by immunofluorescence assay圖 7 western blot 法檢測 HK2 細胞中 SGK-1 的蛋白表達Fig7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western blotSGK-1GAPDH55KD36KD

14 western blot 法檢測 HK2 細胞中 SGK-1 的蛋白表7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western bloNote：△P<0.01 vs CON△△P<0.05 vs CON*P<0.01vs ALD**P<0.05 vs ALD
【學位授予單位】：河北中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2665631