【摘要】：目的:觀察益氣活血解毒中藥血清(Yiqihuoxuejiedu drug serum,TCM)、腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin,ADM)抑制醛固酮(Aldosterone,ALD)誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK2)自噬的作用。方法:本實(shí)驗(yàn)采取HK2細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用1μMol/L醛固酮濃度作為自噬的誘導(dǎo)條件,給予10%的益氣活血解毒含藥血清、100nMol/L的腎上腺髓質(zhì)素治療。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組(CON),醛固酮組(ALD),醛固酮(ALD)+益氣活血解毒含藥血清(TCM),醛固酮(ALD)+腎上腺髓質(zhì)素組(ADM),48小時(shí)后收集細(xì)胞并觀察變化。采用免疫細(xì)胞熒光,Western blot方法檢測(cè)血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid induced kinase,SGK-1),磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,PERK1/2),磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin,P-mTOR),自噬相關(guān)基因5(Autophagy associated gene,Atg5),酵母自噬基因6(Atg6)的同源物Beclin1,自噬標(biāo)志微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表達(dá)。結(jié)果:1免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)自噬通路中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR表達(dá)用激光共聚焦顯微鏡觀察HK2細(xì)胞中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR的表達(dá),結(jié)果顯示ALD刺激后SGK-1表達(dá)明顯增強(qiáng),主要表達(dá)于細(xì)胞漿中,與CON組相比有顯著性差異;TCM、ADM治療組表達(dá)較ALD組明顯減弱。P-ERK1/2在ALD組的表達(dá)較CON組顯著升高,胞漿及細(xì)胞核均見到表達(dá);給以TCM、ADM干預(yù)后,表達(dá)明顯降低。P-mTOR為自噬的負(fù)調(diào)控因子,CON組呈陽(yáng)性表達(dá),以胞漿為主,而ALD組表達(dá)明顯減弱,TCM、ADM干預(yù)后較ALD組表達(dá)增強(qiáng)。2免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)HK2細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg5,Beclin1和LC3的表達(dá)結(jié)果顯示,ALD組自噬相關(guān)蛋白Atg5,Beclin1與CON相比均明顯增多,主要分布在胞漿中,TCM及ADM組較ALD組明顯減弱。CON組LC3在胞漿散在分布,而ALD誘導(dǎo)后,自噬體膜形成且主要與溶酶體融合,形成自噬溶酶體,自噬溶酶體在細(xì)胞質(zhì)中成顆粒狀分布,TCM、ADM干預(yù)后胞漿中顆粒狀物質(zhì)減少,且LC3明顯散在分布整個(gè)胞漿。3 Western blot檢測(cè)HK2細(xì)胞SGK-1,P-ERK1/2,Atg5,Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)Western blot結(jié)果顯示自噬信號(hào)通路中ALD組中SGK-1、P-ERK/ERK表達(dá)明顯高于CON組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),TCM、ADM均可抑制其表達(dá),兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。檢測(cè)自噬抑制蛋白mTOR的表達(dá),P-mTOR及總蛋白水平在ALD組均較CON組下調(diào),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),給以TCM、ADM治療后,可以上調(diào)其表達(dá)。自噬相關(guān)蛋白Atg5,Beclin1,LC3是自噬過程中最重要的正調(diào)節(jié)因子,參與自噬體的形成,其中ALD組,Atg5,Beclin1,LC3較CON組表達(dá)增強(qiáng),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),TCM、ADM組與ALD組相比明顯降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1醛固酮可誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬2腎上腺髓質(zhì)素可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑拮抗鹽皮質(zhì)激素受體復(fù)合物的活化所誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而起到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用3益氣活血解毒中藥可抑制人近端腎小管上皮細(xì)胞自噬,其可能的機(jī)制與下調(diào)SGK-1,P-ERK1/2的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè) HK2 細(xì)胞中 SGK-1 的蛋白表達(dá)（oil×630）Fig1 Expression of SGK-1 in HK2 cells by immunofluorescence assay圖 7 western blot 法檢測(cè) HK2 細(xì)胞中 SGK-1 的蛋白表達(dá)Fig7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western blotSGK-1GAPDH55KD36KD

14 western blot 法檢測(cè) HK2 細(xì)胞中 SGK-1 的蛋白表7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western bloNote：△P<0.01 vs CON△△P<0.05 vs CON*P<0.01vs ALD**P<0.05 vs ALD
【學(xué)位授予單位】：河北中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2665631