【摘要】：世界衛(wèi)生組織明確將肥胖列為疾病的一種。肥胖可引發(fā)糖尿病、高血壓、心功能受損、癌癥等多種疾病,且對(duì)人類造成的威脅日益劇增,嚴(yán)重威脅著各個(gè)年齡段肥胖人群的健康。因此,對(duì)肥胖產(chǎn)生機(jī)制和治療研究成為科研領(lǐng)域迫切渴望解決的難題。藥物靶標(biāo)是藥物研發(fā)重中之重,為疾病治療提供新途徑,為藥物篩選提供新突破口。近年來,科學(xué)領(lǐng)域不斷發(fā)展,隨之也產(chǎn)生了一些新興的藥物靶標(biāo)找尋技術(shù),給肥胖癥患者帶來了福音。本課題主要對(duì)連翹苷的減肥靶標(biāo)進(jìn)行了初步識(shí)別與驗(yàn)證。首先在細(xì)胞水平上對(duì)連翹苷的減肥作用進(jìn)行了確認(rèn);其次運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)連翹苷潛在減肥作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè);然后一方面用DARTS技術(shù)結(jié)合電泳實(shí)驗(yàn)找尋連翹苷靶標(biāo),另一方面用分子對(duì)接技術(shù)研究了連翹苷與PDE3B的相互作用;最后基于上述研究結(jié)果及文獻(xiàn)調(diào)研推測(cè)連翹苷的減肥靶標(biāo)可能為PDE3B,并分別從細(xì)胞水平與分子水平對(duì)其展開驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下:1.連翹苷減肥作用確認(rèn)。主要利用MTT法、熒光染色法進(jìn)行研究。結(jié)果表明:當(dāng)濃度為1-100μM時(shí),連翹苷對(duì)HepG2細(xì)胞存活率無影響。用DMEM高糖培養(yǎng)基(30 mM D-glucose)孵育HepG2細(xì)胞,構(gòu)建脂滴累積細(xì)胞模型,然后用不同濃度連翹苷孵育細(xì)胞,用尼羅紅對(duì)HepG2肝細(xì)胞進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨著連翹苷濃度(1.25、2.5、5μM)的增加有所減弱,當(dāng)連翹苷濃度≥5μM時(shí),HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本保持不變。以上研究表明連翹苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HepG2肝細(xì)胞中脂滴的積累,即在細(xì)胞水平上連翹苷確實(shí)具有減肥作用。2.連翹苷潛在減肥作用靶標(biāo)的虛擬篩選。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一信息學(xué)手段進(jìn)行靶標(biāo)篩選。首先依據(jù)反向藥效團(tuán)匹配方法預(yù)測(cè)連翹苷靶點(diǎn)(成分靶點(diǎn)),然后與GeneCards與CooLGeN數(shù)據(jù)庫篩選得到的肥胖靶點(diǎn)(疾病靶點(diǎn))比對(duì)分析,采用Cytoscape軟件構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,采用ClueGO軟件對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分類富集分析與KEGG通路分析。結(jié)果表明:網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中共得到27個(gè)連翹苷潛在減肥作用靶點(diǎn),其中PDE3B即是27個(gè)靶點(diǎn)之一。GO分類富集中,生物過程分析表明其主要參與調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞增殖、胰液分泌、一氧化氮介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、超氧化物代謝、I-κB激酶/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)、維甲酸受體信號(hào)、脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、殼聚糖的分泌與運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)生物過程;分子功能分析表明相關(guān)靶點(diǎn)主要參與核受體活動(dòng),影響氧化還原酶活性,作為受體參與過氧化作用,與類視黃醇X受體結(jié)合等分子功能。KEGG通路分析表明,預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)涉及小細(xì)胞肺癌通路與脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控通路。3.連翹苷減肥作用靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)篩選。首先采用DARTS技術(shù),結(jié)合SDS-PAGE電泳進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別,分別從鏈霉蛋白酶E的濃度、水解時(shí)長(zhǎng)、水解溫度等方面探索連翹苷的靶標(biāo)蛋白,其次運(yùn)用分子對(duì)接研究連翹苷與PDE3B相互作用。DARTS/SDS-PAGE結(jié)果顯示:電泳條帶中未能觀察到明顯的蛋白濃度差異條帶,主要?dú)w因于DARTS技術(shù)較難找到低豐度靶蛋白,經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,推測(cè)PDE3B可能為連翹苷潛在減肥作用靶標(biāo)。分子對(duì)接結(jié)果表明,一方面連翹苷與PDE3B的Total-Score大于米力農(nóng)(milrinone,PDE3抑制劑),另一方面連翹苷與PDE3B之間有7個(gè)氫鍵形成,而米力農(nóng)與PDE3B間無氫鍵形成。因此,連翹苷極有可能為PDE3B潛在抑制劑。4.連翹苷減肥作用靶標(biāo)驗(yàn)證(PDE3B)。分別從細(xì)胞水平和分子水平展開驗(yàn)證。細(xì)胞水平上首先對(duì)連翹苷和米力農(nóng)競(jìng)爭(zhēng)同一靶標(biāo)PDE3B進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其次用ELISA試劑盒法對(duì)連翹苷是否能抑制靶標(biāo)PDE3B,從而可提高cAMP含量進(jìn)行驗(yàn)證;分子水平上合成PDE3B基因,構(gòu)建pET-28a-PDE3B重組質(zhì)粒,對(duì)PDE3B蛋白表達(dá)、復(fù)性、純化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明:細(xì)胞水平上,米力農(nóng)抑制HepG2肝細(xì)胞中脂質(zhì)的積累,并且連翹苷與米力農(nóng)競(jìng)爭(zhēng)同一活性位點(diǎn);同時(shí),連翹苷能夠增加肝細(xì)胞中的cAMP含量。因此,連翹苷可能是PDE3B的潛在抑制劑,即PDE3B可能是連翹苷的減肥靶標(biāo)。分子水平上,由于PDE3B中疏水氨基酸較多,在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及Ca~(2+)濃度等條件考察后,結(jié)果表明其主要以包涵體形式存在,由于PDE3B蛋白變性后復(fù)性較為困難,分子水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。
【圖文】：

第一章 綜述子化合物。研究者利用 FK506 和雷帕霉素（Rapamycin）免疫抑制劑 K506 結(jié)合蛋白12（FKBP12）進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶水解后，與對(duì)照組相比，與 rapamycin或者 FK506 結(jié)合后的 FKBP12 的蛋白條帶較寬，較明顯，即沒有被水解或水解較少，從而驗(yàn)證了 DARTS 技術(shù)的正確性。但研究者考慮到 rapamycin 或者 FK506 是一種可以獲得的特定的、高效的藥物（活性小分子化合物），且與 FKBP12 結(jié)合活性較強(qiáng)，所以研究者決定檢測(cè) DARTS 這一技術(shù)是否仍適用于一種更弱的抑制劑，又采用 E4與其目標(biāo)蛋白 mTOR 相互作用，從其具有抗嗜熱菌蛋白酶的水解實(shí)驗(yàn)中再一次證明了這一靶標(biāo)辨識(shí)技術(shù)手段的可行性。由此 DARTS 技術(shù)在藥物靶標(biāo)找尋中漸漸被人們熟知起來。AB

酶（Phosphodiesterases，PDEs）在動(dòng)植物細(xì)胞和微生要作用，它與腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate Cyclase，AC著細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（CyclicAdenosine Monophospha一種環(huán)狀核苷酸，當(dāng)外來信號(hào)刺激細(xì)胞表面并經(jīng)跨膜傳信號(hào)分子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合形成復(fù)合體，從而進(jìn)，被激活的 Gs 蛋白再進(jìn)一步激活細(xì)胞膜上的 AC，AC 合形成 cAMP。cAMP 是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，它能夠aseA，PKA，cAMP 依賴性蛋白激酶），使相應(yīng)的靶細(xì)相關(guān)細(xì)胞反應(yīng)的作用。發(fā)揮作用后的 cAMP 會(huì)進(jìn)一步被Adenosine-5’-Monophosphate，5’-AMP）而失活[62]，從的生化作用。與此同時(shí)，，PDEs 也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中第二nosine Monophosphate，cGMP）的濃度（具體過程見圖
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2664505