【摘要】：急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)和呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種通過直接或間接因素導(dǎo)致的肺泡毛細(xì)血管屏障受損,炎性細(xì)胞浸潤、促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的致命性疾病,進(jìn)而造成急性進(jìn)展性頑固性呼吸衰竭,最終形成不可逆的肺間質(zhì)纖維化。ALI已嚴(yán)重影響患者呼吸系統(tǒng)功能,生活質(zhì)量甚至危及生命,即使應(yīng)用目前現(xiàn)有的臨床治療措施,但該病最終仍會進(jìn)展成為肺間質(zhì)纖維化,大大降低患者的生活質(zhì)量,且無特效藥物逆轉(zhuǎn)該疾病的形成及進(jìn)展。研發(fā)治療肺損傷的藥物,提升病患生活質(zhì)量,降低患者死亡率,已成為目前亟需解決的問題。ALI及特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)本質(zhì)上是呼吸道及肺組織中的失控性炎癥及氧化反應(yīng)。博來霉素(Bleomycin,BLM)是糖肽類抗真菌藥物,此藥物目前多用于經(jīng)氣管給藥至小鼠肺內(nèi),模擬急性肺損傷及纖維化的發(fā)病過程,誘導(dǎo)ALI和纖維化動(dòng)物模型。BLM刺激肺組織初期可引起炎癥及氧化反應(yīng),產(chǎn)生并加重急性肺損傷病情及進(jìn)展,最終形成IPF,因此控制炎癥和氧化-抗氧化失衡是改善肺損傷的關(guān)鍵因素。再者,轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)在肺損傷轉(zhuǎn)為肺間質(zhì)纖維化發(fā)病病程中,是促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白的主要細(xì)胞因子。桑黃是一種多孔菌屬,研究證實(shí)其有益于改善血液循環(huán)、緩解胃痛、抗炎、抗腫瘤、控制糖尿病和肺部感染。我們前期研究發(fā)現(xiàn)桑黃乙酸乙酯提取物(主要成分為多酚類物質(zhì))具有抗氧化、抗增殖和抗微生物等生物活性。然而,其是否具有緩解肺損傷等作用仍不清楚。本研究利用BLM誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型及體外TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化細(xì)胞模型來探討桑黃提取物(I.sanghuang extract,ISE)在ALI及肺間質(zhì)纖維化中可能的保護(hù)作用,并初步探討其潛在的作用機(jī)制。1.桑黃提取物在BLM誘導(dǎo)的急性肺損傷中的保護(hù)作用目的本章旨在從抗炎及抗氧化作用途徑探究桑黃提取物對BLM誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型中的保護(hù)作用及機(jī)制探討。方法將C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為4組,每組24只,分別為正常對照組、BLM組、BLM+0.15%ISE組、BLM+0.6%ISE組。各組小鼠提前攝入4周含有不同濃度的桑黃提取物飼料或正常飼料后,經(jīng)BLM誘導(dǎo)后3天處死,收集以下標(biāo)本并進(jìn)行如下相關(guān)分析:(1)肺組織:HE染色病理切片觀察形態(tài)學(xué)改變,稱重肺組織評價(jià)干濕重比的變化,用蛋白印跡分析法(Western blot,WB)探究MAPK和NF-κB信號通路的影響,生化試劑盒測肺組織中MDA水平及SOD、CAT和GSH-Px酶活性;(2)支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF):采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及亞群分類,用生化試劑盒檢測BALF中總蛋白水平以及用ELISA法檢測BALF中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;(3)脾臟:分離脾細(xì)胞通過FCM檢測中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群分布并經(jīng)LPS刺激24h后,ELISA檢測其上清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平;通過FCM檢測T淋巴細(xì)胞亞群中CD3的表達(dá),以及經(jīng)ConA刺激72h后,FCM評價(jià)T淋巴細(xì)胞增殖的變化,ELISA檢測其脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的變化。結(jié)果(1)ISE可以改善ALI病理特征,減少BALF內(nèi)總蛋白滲出,降低BALF中炎癥細(xì)胞的聚集及促炎細(xì)胞因子IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)和TNF-α(P0.05)的水平;(2)ISE可減少肺部脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生(P0.05),增強(qiáng)抗氧化酶SOD(P0.05)、CAT(P0.05)和GSH-Px(P0.05)清除自由基的活性;(3)ISE能夠抑制NF-κB信號通路(P0.05),但不影響MAPK信號通路;(4)ISE對脾細(xì)胞各亞群分布、LPS刺激產(chǎn)生炎癥因子應(yīng)答和ConA刺激后T細(xì)胞增殖及免疫應(yīng)答影響較小,其中僅對細(xì)胞因子IL-1β及IL-2具有調(diào)節(jié)用作。小結(jié)桑黃提取物可減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠ALI,該保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵可能是通過抗炎和抗氧化等實(shí)現(xiàn)的,其作用機(jī)制可能是與桑黃提取物影響NF-κB信號通路相關(guān)。2.桑黃提取物對TGF-β誘導(dǎo)人肺腺癌肺泡上皮細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的保護(hù)作用目的本章旨在研究桑黃提取物對TGF-β誘導(dǎo)人肺腺癌肺泡上皮細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究。方法將生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常組、TGF-β組、TGF-β+ISE(2μg/mL)組、TGF-β+ISE(4μg/mL)組。用濃度為2μg/mL和4μg/mL的桑黃提取物分別對A549細(xì)胞預(yù)處理1h后,加入TGF-β(5ng/mL)對其進(jìn)行誘導(dǎo)。24h后觀察細(xì)胞形態(tài),收集細(xì)胞進(jìn)行檢測,WB法檢測細(xì)胞中的E-Cadherin、Vimentin、Snail、α-SMA、p-Samd2/3、Smad2/3的變化。其次,用CCK-8試劑盒檢測桑黃提取物是否對A549細(xì)胞具有毒性作用。結(jié)果(1)ISE能改善TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞纖維化形態(tài)變化及遷移能力;(2)ISE能夠抑制細(xì)胞上皮型向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化;(3)ISE可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制可能是通過影響Smad2/3的活化實(shí)現(xiàn)的,而不是通過ISE的直接毒性作用所介導(dǎo)的。小結(jié)桑黃提取物抑制TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用機(jī)制可能通過影響Smad2/3通路活性實(shí)現(xiàn)的。3.結(jié)論本研究從體內(nèi)外初步探討桑黃提取物對BLM誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,TGF-β誘導(dǎo)人肺腺癌肺泡上皮細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化兩個(gè)模型的藥理作用。機(jī)制結(jié)果提示桑黃提取物在肺損傷早期具有抗炎和抗氧化的效應(yīng),該效應(yīng)可能是通過影響NF-κB信號通路所介導(dǎo)的,同時(shí)在肺損傷晚期抗纖維化作用可能與調(diào)控Smad2/3信號通路有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 桑黃提取物對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠體重影響提取物在博萊霉素誘導(dǎo)前（A）和博萊霉素誘導(dǎo)后（B）體重下數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=12 只/組），ISE 表示桑黃提取物，BLM 表示

圖 2 桑黃提取物對博萊霉素引起急性肺損傷病理學(xué)變化照組，10×；（B）BLM 組，10×；（C）BLM+0.15%ISE 組，10×E）肺組織病理學(xué)評分。與正常對照組相比，*P<0.05；與 BLM 組相E 組相比，▲P<0.05。數(shù)值是以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=12 只/組）。I
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2663670