【摘要】：急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)和呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種通過直接或間接因素導致的肺泡毛細血管屏障受損,炎性細胞浸潤、促炎細胞因子和氧化應激反應產(chǎn)生的致命性疾病,進而造成急性進展性頑固性呼吸衰竭,最終形成不可逆的肺間質(zhì)纖維化。ALI已嚴重影響患者呼吸系統(tǒng)功能,生活質(zhì)量甚至危及生命,即使應用目前現(xiàn)有的臨床治療措施,但該病最終仍會進展成為肺間質(zhì)纖維化,大大降低患者的生活質(zhì)量,且無特效藥物逆轉(zhuǎn)該疾病的形成及進展。研發(fā)治療肺損傷的藥物,提升病患生活質(zhì)量,降低患者死亡率,已成為目前亟需解決的問題。ALI及特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)本質(zhì)上是呼吸道及肺組織中的失控性炎癥及氧化反應。博來霉素(Bleomycin,BLM)是糖肽類抗真菌藥物,此藥物目前多用于經(jīng)氣管給藥至小鼠肺內(nèi),模擬急性肺損傷及纖維化的發(fā)病過程,誘導ALI和纖維化動物模型。BLM刺激肺組織初期可引起炎癥及氧化反應,產(chǎn)生并加重急性肺損傷病情及進展,最終形成IPF,因此控制炎癥和氧化-抗氧化失衡是改善肺損傷的關鍵因素。再者,轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)在肺損傷轉(zhuǎn)為肺間質(zhì)纖維化發(fā)病病程中,是促進成纖維細胞產(chǎn)生膠原蛋白的主要細胞因子。桑黃是一種多孔菌屬,研究證實其有益于改善血液循環(huán)、緩解胃痛、抗炎、抗腫瘤、控制糖尿病和肺部感染。我們前期研究發(fā)現(xiàn)桑黃乙酸乙酯提取物(主要成分為多酚類物質(zhì))具有抗氧化、抗增殖和抗微生物等生物活性。然而,其是否具有緩解肺損傷等作用仍不清楚。本研究利用BLM誘導的ALI動物模型及體外TGF-β誘導肺纖維化細胞模型來探討桑黃提取物(I.sanghuang extract,ISE)在ALI及肺間質(zhì)纖維化中可能的保護作用,并初步探討其潛在的作用機制。1.桑黃提取物在BLM誘導的急性肺損傷中的保護作用目的本章旨在從抗炎及抗氧化作用途徑探究桑黃提取物對BLM誘導的ALI動物模型中的保護作用及機制探討。方法將C57BL/6雌性小鼠隨機分為4組,每組24只,分別為正常對照組、BLM組、BLM+0.15%ISE組、BLM+0.6%ISE組。各組小鼠提前攝入4周含有不同濃度的桑黃提取物飼料或正常飼料后,經(jīng)BLM誘導后3天處死,收集以下標本并進行如下相關分析:(1)肺組織:HE染色病理切片觀察形態(tài)學改變,稱重肺組織評價干濕重比的變化,用蛋白印跡分析法(Western blot,WB)探究MAPK和NF-κB信號通路的影響,生化試劑盒測肺組織中MDA水平及SOD、CAT和GSH-Px酶活性;(2)支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF):采用流式細胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測BALF中炎癥細胞總數(shù)及亞群分類,用生化試劑盒檢測BALF中總蛋白水平以及用ELISA法檢測BALF中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;(3)脾臟:分離脾細胞通過FCM檢測中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞亞群分布并經(jīng)LPS刺激24h后,ELISA檢測其上清細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平;通過FCM檢測T淋巴細胞亞群中CD3的表達,以及經(jīng)ConA刺激72h后,FCM評價T淋巴細胞增殖的變化,ELISA檢測其脾細胞上清細胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的變化。結(jié)果(1)ISE可以改善ALI病理特征,減少BALF內(nèi)總蛋白滲出,降低BALF中炎癥細胞的聚集及促炎細胞因子IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)和TNF-α(P0.05)的水平;(2)ISE可減少肺部脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生(P0.05),增強抗氧化酶SOD(P0.05)、CAT(P0.05)和GSH-Px(P0.05)清除自由基的活性;(3)ISE能夠抑制NF-κB信號通路(P0.05),但不影響MAPK信號通路;(4)ISE對脾細胞各亞群分布、LPS刺激產(chǎn)生炎癥因子應答和ConA刺激后T細胞增殖及免疫應答影響較小,其中僅對細胞因子IL-1β及IL-2具有調(diào)節(jié)用作。小結(jié)桑黃提取物可減輕BLM誘導的小鼠ALI,該保護效應的關鍵可能是通過抗炎和抗氧化等實現(xiàn)的,其作用機制可能是與桑黃提取物影響NF-κB信號通路相關。2.桑黃提取物對TGF-β誘導人肺腺癌肺泡上皮細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的保護作用目的本章旨在研究桑黃提取物對TGF-β誘導人肺腺癌肺泡上皮細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的保護作用及其機制研究。方法將生長狀態(tài)良好的A549細胞隨機分為4組:正常組、TGF-β組、TGF-β+ISE(2μg/mL)組、TGF-β+ISE(4μg/mL)組。用濃度為2μg/mL和4μg/mL的桑黃提取物分別對A549細胞預處理1h后,加入TGF-β(5ng/mL)對其進行誘導。24h后觀察細胞形態(tài),收集細胞進行檢測,WB法檢測細胞中的E-Cadherin、Vimentin、Snail、α-SMA、p-Samd2/3、Smad2/3的變化。其次,用CCK-8試劑盒檢測桑黃提取物是否對A549細胞具有毒性作用。結(jié)果(1)ISE能改善TGF-β誘導的A549細胞纖維化形態(tài)變化及遷移能力;(2)ISE能夠抑制細胞上皮型向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化;(3)ISE可以抑制TGF-β誘導的A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制可能是通過影響Smad2/3的活化實現(xiàn)的,而不是通過ISE的直接毒性作用所介導的。小結(jié)桑黃提取物抑制TGF-β誘導的A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用機制可能通過影響Smad2/3通路活性實現(xiàn)的。3.結(jié)論本研究從體內(nèi)外初步探討桑黃提取物對BLM誘導的小鼠急性肺損傷,TGF-β誘導人肺腺癌肺泡上皮細胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化兩個模型的藥理作用。機制結(jié)果提示桑黃提取物在肺損傷早期具有抗炎和抗氧化的效應,該效應可能是通過影響NF-κB信號通路所介導的,同時在肺損傷晚期抗纖維化作用可能與調(diào)控Smad2/3信號通路有關。
【圖文】：

圖 1 桑黃提取物對博萊霉素誘導的小鼠體重影響提取物在博萊霉素誘導前（A）和博萊霉素誘導后（B）體重下數(shù)±標準偏差（n=12 只/組），ISE 表示桑黃提取物，BLM 表示

圖 2 桑黃提取物對博萊霉素引起急性肺損傷病理學變化照組，10×；（B）BLM 組，10×；（C）BLM+0.15%ISE 組，10×E）肺組織病理學評分。與正常對照組相比，*P<0.05；與 BLM 組相E 組相比，▲P<0.05。數(shù)值是以平均數(shù)±標準偏差（n=12 只/組）。I
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2663670