【摘要】：植物內(nèi)生真菌是高度多樣性的微生物類群,其次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富多樣,具有合成與宿主植物相同或相似化學(xué)成分的能力。羅漢果(Siraitia grosvenori)是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物,羅漢果果實(shí)中的皂甙、多糖、黃酮等都具有很好的抗氧化活性。這表明羅漢果內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生具有抗氧化活性的代謝產(chǎn)物,可能是抗氧化活性物質(zhì)的重要來源。本論文采用活性追蹤的方法,對(duì)桂林龍勝縣羅漢果內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。內(nèi)容包括:新鮮羅漢果內(nèi)生真菌的分離;抗氧化活性研究;活性成分的追蹤與分離。研究主要內(nèi)容和結(jié)果分析:1、羅漢果內(nèi)生真菌的分離與化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)采用植物組織塊切割法,從新鮮的羅漢果中分離出15株內(nèi)生真菌,挑選10株優(yōu)勢菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中26℃、170 r/min搖床發(fā)酵6 d,發(fā)酵結(jié)束后,減壓抽濾分離發(fā)酵液與菌絲體。發(fā)酵液濃縮至浸膏,菌絲體50℃烘干,粉碎,再分別用石油醚、乙醇和水溶液提取,提取物進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn),初步了解菌株代謝產(chǎn)物所含的化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,大部分內(nèi)生真菌含有多糖、黃酮、蒽醌、有機(jī)酸等化學(xué)成分。2、活性菌株的篩選與鑒定采用清除1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、清除羥自由基(·OH)和總還原力3種方法對(duì)10株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性的篩選。結(jié)果表明,10株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的總還原力和對(duì)DPPH·、·OH表現(xiàn)出良好的清除力,最后篩選出一株發(fā)酵液和菌絲體都具有較強(qiáng)抗氧化能力的菌株F-5。當(dāng)菌株F-5發(fā)酵產(chǎn)物濃度為1 mg/m L時(shí),發(fā)酵液對(duì)DPPH·和·OH清除率分別為74.09%和64.74%,菌絲體的清除率分別為73.56%和55.32%,小于同濃度Vc對(duì)DPPH·清除率(99.36%)和對(duì)·OH清除率(95.77%)。發(fā)酵液與菌絲體總還原力分別為1.547和1.241,大于同濃度Vc的總還原力(1.145),數(shù)據(jù)表明F-5菌株具有較強(qiáng)的抗氧化活性。因此,選取對(duì)自由基清除率最高的菌株F-5進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將菌株F-5在PDA培養(yǎng)基上劃線,26℃培養(yǎng)4-5 d,菌落生長較快,質(zhì)地疏松,剛開始生長的菌絲白色帶黃色,隨后變?yōu)榈G色或者褐色。提取菌株F-5的DNA,采用通用引物進(jìn)行18s r DNA基因PCR擴(kuò)增。測定結(jié)果顯示,該序列長度為576 bp。將序列通過BLAST和Gen Bank已有的序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,可知該菌株與Aspergillus oryzae有99%的同源性,結(jié)合菌落形態(tài)觀察,得出該菌株為米曲霉(spergillus oryzae)。3、菌株發(fā)酵條件優(yōu)化采用單因素試驗(yàn),研究碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株抗氧化活性的影響,并在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉和初始p H值四個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),以發(fā)酵液對(duì)DPPH·和·OH清除率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),進(jìn)一步優(yōu)化菌株抗氧化活性條件。結(jié)果表明,最佳氮源為蛋白胨,最佳碳源為葡萄糖,最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d,最佳初始p H值為6~7,菌株對(duì)自由基清除的影響因素依次為:氯化鈉葡萄糖蛋白胨初始p H值。菌株F-5最佳優(yōu)化條件為A4B1C1D2,即葡萄糖35 g,蛋白胨2.0 g,Na Cl 0.5 g,初始p H值為6~7。此條件下對(duì)菌株F-5進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH·和·OH清除率分別為97.53%和84.43%。說明菌株F-5發(fā)酵產(chǎn)生抗氧化活性成分的最佳條件為A4B1C1D2。4、抗氧化活性部位的篩選采用菌株F-5優(yōu)化的條件進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后,得到的發(fā)酵液采用液-液萃取法用石油醚、氯仿、乙酸乙酯三種有機(jī)溶劑按極性由小到大對(duì)發(fā)酵原液進(jìn)行萃取,回收有機(jī)溶劑,獲得原液、3個(gè)萃取相和水相五種部分。采用3種方法測定5種浸膏的抗氧化能力并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn),追蹤抗氧化活性部位與成分。由結(jié)果可知,當(dāng)樣品濃度為1mg/m L時(shí),乙酸乙酯相和水相對(duì)DPPH·清除率分別為76.88%、73.53%;對(duì)·OH清除率為62.21%、61.98%;總還原力為0.736、0.615。清除自由基能力高于其余三個(gè)萃取相,表明羅漢果內(nèi)生真菌具有一定的抗氧化活性,其活性部位主要集中在乙酸乙酯相和水相。5、抗氧化活性部位的純化及活性成分的追蹤和結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)原液濃縮時(shí),有物質(zhì)析出,為化合物A。再采用大孔吸附樹脂AB-8對(duì)活性部位水相和乙酸乙酯相進(jìn)行初步分離,分別用蒸餾水和80%乙醇洗脫。當(dāng)水相的水洗脫液濃度相當(dāng)于500 mg/m L原液重時(shí),水相的水洗脫液具有較強(qiáng)的抗氧化活性,對(duì)DPPH·和·OH清除率分別為80.85%和66.01%,小于Vc(1 mg/m L)的清除率分別為99.36%和95.77%;而乙酸乙酯相的水洗脫液對(duì)DPPH·和·OH清除率只有51.79%和41.56%。水相的80%乙醇洗脫液對(duì)DPPH·和·OH清除率分別為70.11%和46.25%;乙酸乙酯相的80%乙醇洗脫液對(duì)DPPH·清除率和·OH清除率分別為38.79%和23.42%。從中擇優(yōu)選取對(duì)DPPH·和·OH清除率最好的水相水洗脫液做后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用80%的乙醇對(duì)水相的水洗脫液進(jìn)行醇沉反應(yīng),沉淀物為樣1,醇濃縮為樣2,抗氧化活性測定結(jié)果表明樣1樣2。當(dāng)樣1的濃度相當(dāng)于500 mg/m L原液重時(shí),對(duì)DPPH·清除率為90.60%,對(duì)·OH清除率為79.69%,樣1的清除率接近于Vc(1 mg/m L),它對(duì)DPPH·清除率為99.36%,對(duì)·OH清除率為95.77%。樣2對(duì)DPPH·清除率和對(duì)·OH清除率分別為38.89%和23.42%。因此,選取樣1繼續(xù)追蹤抗氧化活性成分。用無水乙醇對(duì)樣1進(jìn)行醇洗去單糖時(shí),濃縮醇洗液得到化合物B,不溶物為粗多糖。粗多糖經(jīng)過葡聚糖凝膠繼續(xù)分離,得到化合物C。對(duì)化合物A、B、C的抗氧化能力測定得出,當(dāng)化合物A、B、C的濃度分別為500 mg/m L時(shí),對(duì)DPPH·清除率分別為46.29%、12.36%、96.35%;對(duì)·OH清除率分別為35.48%、3.18%、92.85%;總還原力分別為0.496、0.009、1.23。其中多糖類的化合物C抗氧化能力最強(qiáng),化合物B次之,化合物A最低。采用安捷倫紫外光譜掃描(UV)、400MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀、紅外光譜儀等結(jié)構(gòu)鑒定方法對(duì)化合物A、B、C進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物A、B的1H NMR和13CNMR測定結(jié)果分別與文獻(xiàn)報(bào)道的甘露糖、麥芽糖顯示的1H NMR、13CNMR譜數(shù)據(jù)相一致,說明化合物A為甘露糖,化合物B為麥芽糖�；衔顲的紫外光譜掃描(UV)結(jié)果顯示在260 nm和280 nm均無出現(xiàn)峰值,表明不含有核酸和蛋白,紅外光譜(IR)顯示,化合物C含有四個(gè)多糖類物質(zhì)的特征吸收峰,說明化合物C為多糖類物質(zhì)。本研究獲得一個(gè)來自于羅漢果內(nèi)生真菌——米曲霉所產(chǎn)的具有較強(qiáng)抗氧化活性的成分多糖類化合物,本研究可為進(jìn)一步抗氧化劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

F-9 F-10圖 2-1 10 株內(nèi)生真菌菌落形態(tài)Fig.2-1 10 strains of endophytic fungi colony morphology表 2-1 新鮮羅漢果內(nèi)生真菌形態(tài)特征Tab. 2-1 Endophytic fungi of fresh siraitia grosvenorii morphological characteristics菌株編號(hào) 正面顏色 背面顏色 質(zhì)地 生長速度F-1 白色 淡紅色 絨毛 較快F-2 灰綠帶白色 紅色 毯狀 緩慢F-3 白色 白色 絨毛 較慢F-4 淺褐色帶白色 黑色 絨毛 快

F-5 菌株的發(fā)酵液與菌絲體對(duì) DPPH·和·OH強(qiáng)大于陽性對(duì)照 Vc，所以選擇 F-5 菌株做抗氧化活F-5 的形態(tài)鑒定 F-5 接種于 PDA 培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng) 3 d，結(jié)果見圖 3 4~5 cm；菌落呈圓形，外觀比較干燥，質(zhì)地疏松變?yōu)辄S褐色或者淡綠褐色，菌株背面無色。光學(xué)顯頭放射狀，，分生孢子呈球形或近球形，一般 4~5 μm
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285;S567.19

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2663546